BMP-2遺伝子発現ベクターとRANKL結合ペプチドによる新規骨形成法の開発

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K11900
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 佐藤 俊三 東京医科歯科大学, 歯学部, 非常勤講師 (20769468)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 河井 まりこ 大阪歯科大学, 歯学部, 講師 (40379839) ; 青木 和広 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (40272603)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 遺伝子導入 / 非ウイルスベクター / BMP-2 / 骨形成 / 足場材料 / RANKL結合ペプチド

Outline of Annual Research Achievements

骨形成を促進する試薬として知られているタンパク質であるBMP-2 には、ヒトに骨形成を導くためにはBMP-2の大量投与が必要であり、そのために、炎症が惹起される。また、大量の精製タンパク質が必要なためにコスト面の問題もあり、広く臨床応用はされていない。我々はこれらBMP-2の問題を抑えるために、BMP-2と骨形成促進ペプチドとの併用によりBMP-2の使用量を抑えても骨形成を促進できる方法を開発してきた。
一方、BMP-2 の遺伝子を導入する場合は局所注射でタンパク誘導が可能であり、必要以上のBMP-2が発現せず、タンパク精製の必要が無いため、費用も抑えられる。先行実験では、レトロウイルスを用いた遺伝子発現ベクターでは、うまく骨を誘導できたが、ウイルスベクターに比べてより安全な非ウイルス性ベクターを用いて、BMP-2遺伝子を発現させてみると骨形成量は、ウイルスベクター使用時比べて少量であった。
そこで、本研究では、BMP-2 遺伝子発現非ウイルス性ベクターと、BMP-2 誘導による骨形成を促進するRANKL 結合ペプチドとの併用により、非ウイルスベクターの低い骨誘導能を補えなると仮定し、実験を始めた。
大阪歯科大がとの共同研究により、精製したBMP-2あるいはBMP-2/7を用いて骨を誘導することを試みた。2017年度行った実験を何度か行ったが、ベクターのみの群に比べて、ペプチドの担体である粒子状のゼラチンハイドロゲルのみを注射した群のほうが大きな新生骨が現れた。予想と反して、骨形成ペプチドを注射した群では新生骨量は少なかった。
モデルを変えて、マウスの頭蓋骨欠損部にGFPを組み込んだBMP-2ベクターを用い、さらにカチオン性の担体にベクターを含浸させることにより、エレクトロポレーションを行わずに遺伝子導入を行ったが、骨形成促進ペプチドによる相乗効果は認められなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

BMP-2/7のヘテロダイマーの遺伝子導入により、マウスの筋肉内に異所性骨石灰化を誘導することができたが、骨形成促進ペプチドによる相乗効果が認められなかったため、骨欠損部に新生骨を誘導する実験系で再度骨形成促進ペプチドの相乗効果を試した。結果はやはり、ペプチドの効果は認められなかった。
カチオン性の担体を用いることによりエレクトロポレーションを行わずとも、遺伝子導入が可能となり骨誘導が観察されたことは、興味深い。ただ、本研究の目的が導入効率が悪い非ウイルス性ベクターの欠点を補う方法として骨形成促進ペプチドの添加効果は明らかでなかったことから、やや遅れていると判断した。

Strategy for Future Research Activity

使用している骨形成促進ペプチドは、RANKL分子に親和性の高いペプチドであり、その骨形成促進作用の発現は骨芽細胞上のRANKL分子に結合し、骨芽細胞を直接刺激することが考えられている。我々はRANKLが骨形成促進の受容体として働くことにより、骨芽細胞分化を促進することを発表したが、我々の骨形成促進ペプチドが作用するためには、RANKLを発現する細胞の周りにペプチドがうまく存在する必要がある。
一方、ペプチドは注入法により投薬しているが、遺伝子が導入された箇所の周囲にペプチドを作用させるためには、相当熟練の技が必要であるため、ペプチドの投与を局所投与ではなく、全身投与に切り替えて、遺伝子導入効率の悪さを補う骨形成促進ペプチドの相乗効果を検討する予定である。

Causes of Carryover

年度末になって、計画していた実験が組めなくなったため、次年度使用分が生じた。当該助成金は、主に消耗品費として使用する予定である。