2018 Fiscal Year Research-status Report

S.mutansのGbpC結合ドメインを用いた齲蝕免疫システムの構築

Research Project

Project/Area Number	17K11961
Research Institution	Okayama University
Principal Investigator	高島由紀子岡山大学, 大学病院, 講師 (30589768)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	仲野道代 (松本道代) 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (30359848)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	Streptococcus mutans / グルカン結合タンパク / GbpC / バイオインフォマティクス
Outline of Annual Research Achievements	齲蝕の主要な病原細菌である Streptococcus mutans の菌体表層には、グルカン結合タンパク C (GbpC) が存在し、齲蝕原性との強い関連性が報告されている。我々はこれまでに、バイオインフォマティクスの手法を用いてアミノ酸配列からタンパクの高次構造を構築し、ループを形成する部分を５カ所抽出し、GbpC のグルカン結合領域の特定を行った。さらに、この結合ドメインをターゲットとする抗体を作製し、抗ペプチド抗体の作用について検討したところ、唾液タンパクのリゾチームと GbpC タンパクの結合を阻害することが明らかとなった。また、ELISA 法を用いて同様の実験を行ったところ、リゾチームが抗ペプチド抗体と直接結合していることがわかった。これらのことから、このような結合ドメインは GbpC と同様に他の高分子タンパクにも存在する可能性が示唆された。また、結合ドメインを欠失させた S. mutans のヒト上皮細胞への付着を蛍光イメージングを用いて測定したところ、付着能が著しく低下した。このことから、ラット動物実験系において、抗ペプチド抗体をラット口腔内へ投与することで齲蝕の発生を抑制する可能性が示唆された。本研究の目的は、抗ペプチド抗体をラットに直接投与するだけではなく、この結合ドメインと同じアミノ酸配列であるペプチドに誘導されたラット粘膜免疫誘導システムにおける有効性を示すことである。本研究を通じて、ペプチドによる粘膜免疫系を確立し、新たな齲蝕抑制物質の１つとして齲蝕ワクチンの開発に繋げていきたいと考えている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason ラット免疫誘導システムを構築するために、はじめにバイオインフォマティクスの手法を用いて特定されたグルカン結合ドメインの抗ペプチド抗体を作製した。決定されたグルカン結合領域のペプチドを作製決定された結合領域のアミノ酸配列より、Life Technology 社に依頼し、アミノ酸の合成ペプチドを得た。ウサギ (ニュージーランドホワイト種;1.5 kg)に上記の合成ペプチドを免疫することにより血清を得た。上記で得られた抗血清の抗体価を ELISA 法およびウェスタンブロッティングによって確認し、実験に供試した。しかしながら、抗体の準備に予想以上に時間が掛かったことにより実験の進捗状況がやや遅れている。また、産前、産後および育児休暇のため、進捗状況がやや遅れている。
Strategy for Future Research Activity	動物実験における予備実験から得られたデータを検討し、投与形態および投与日数等を決定しする。実験動物として、ラットの雄を使用し、得られたペプチドを経口摂取あるいは鼻粘膜への投与により免疫応答反応を誘発した状態で、口腔内に供試菌を定着させ、齲蝕を誘発させる。飼育後、顎骨を無菌的に摘出する。上顎の歯牙をエリスロシンを用いて染色し、プラークスコアを求め、さらに上下顎臼歯の齲蝕スコアを算出し、ペプチドによる齲蝕抑制効果を検討する。さらに、下顎からの供試菌の回収量を調べ、S. mutans 菌株のラットの口腔内における歯牙への定着について検討する。実験期間中には、免疫前と免疫後の血清と唾液の採取を行う。採取した血清と唾液中の抗体価を測定し、ペプチドによる免疫誘導を検討する。また、引き続き他のドメインを探索し分析を行う。これまでに得られたデータにより作製したペプチドの効果が明らかとなった場合には、最も高い効果が得られた条件の探索を行う予定である。ラット動物実験については、これまで行っており予定通り実施できる。
Causes of Carryover	（理由）育児部分休業を１２か月間取得したため。（使用計画）実験動物および飼料、研究に使用する物品および機器の購入