副作用の少ない小児ステロイド性顎骨骨粗鬆症治療における骨吸収阻害薬の開発

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K11968
• Research Institution: Kyushu Dental College
• Principal Investigator: 牧 憲司 九州歯科大学, 歯学部, 教授 (60209400)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松原 琢磨 九州歯科大学, 歯学部, 助教 (00423137) ; 古株 彰一郎 九州歯科大学, 歯学部, 准教授 (30448899) ; 青木 和広 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (40272603) ; 自見 英治郎 九州大学, 歯学研究院, 教授 (40276598)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 破骨細胞 / p130cas / Bif-1 / μCT / 骨密度

Outline of Annual Research Achievements

破骨細胞は骨のリモデリングにおいて骨を骨吸収する多核巨細胞である。我々はこれまでに破骨細胞の骨吸収に重要な分子p130Casを同定し、破骨細胞特異的にp130Casを欠損したマウスを作成した。このマウスを解析すると破骨細胞による骨吸収不全により大理石骨病を呈していた（Nagai Y et al. J Bone Miner Res. 2013 28, 2449）。しかしながら、p130Casがどのようにして破骨細胞の骨吸収機能を制御しているのかは明らかになっていない。本研究ではp130Casと会合する分子を質量分析法にをもちいて網羅的に解析することにより、p130Casの下流で骨吸収に関与する分子を同定し、その機能を明らかにする。１： p130Cas欠損マウス骨髄細胞から誘導した破骨細胞に野生型p130Casあるいはp130Casによる破骨細胞調節機能に重要なSH3領域を欠失した変異体を遺伝子導入し、細胞内タンパク質を抽出した。抽出したタンパク質を免疫沈降および質量分析法により解析し、SH3領域と結合するタンパク質を検索した。
２：野生型マウス骨髄細胞を採取し、破骨細胞に分化させ、破骨細胞におけるBif-1の発現とその局在を確認した。３：shRNAを用いてBif-1をノックダウンすることにより破骨細胞におけるBif-1の機能を検討した。４： Dr. Takahashi(Penn State University)よりBif-1遺伝子欠損マウスを供与いただき、そのマウスを解析した。Real-time PCR法およびWestern Blot法により、破骨細胞分化にともないBif-1の発現量が上昇することを見出した。 野生型およびBif-1欠損マウス大腿骨をμCTおよびpQCTにより骨形態計測した結果、Bif-1欠ウスの大腿骨は野生型マウスに比べ骨密度が増加していた.

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

以下の実験により、Bif-1の破骨細胞における機能を明らかにしていく。
・マウスの解析はまだn数が足りないので、これからn数を増やす。また、μCTによる解析だけでなく、組織的な解析をおこない、破骨細胞の機能におけるBif-1の機能を明らかにしていく。・Bif-1遺伝子欠損マウス骨髄より破骨細胞分化を誘導し、in vitroにおけるBif1の役割を検討する。・免疫沈降法を用いてp130Casや骨吸収に重要な他の分子c-Srcなどとの分子的相互関係を検討する。・Bif-1の機能部位を欠失した変異体を作成し、Bif-1遺伝子欠損マウス由来の破骨細胞に遺伝子導入することにより、Bif-1の分子機能を詳細に検討する。

Strategy for Future Research Activity

Bif-1遺伝子欠損マウスを入手し、その解析によりBif-1がp130Casの下流分子として骨吸収に関与する可能性があるという結果を得ることができ、研究の方針ができたのは大きな前進であった。しかし、試料数が少ないなどこれまで得られたデータのqualityがまだ低く、論文を作成する上では、より高いqualityのデータを収集する必要がある。そのため、さらなる努力によりしっかりとしたデータを蓄積すること

Causes of Carryover

マウスの骨密度測定等に時間を要した。試料数が少ないなどこれまで得られたデータのqualityがまだ低く、論文を作成する上では、より高いqualityのデータを収集する必要がある。そのため、さらなる努力によりしっかりとしたデータを蓄積する必要があるため。