2018 Fiscal Year Research-status Report
顆粒膜の脂質MS解析からせまる，分泌タンパク質の濃縮メカニズムの解明
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17K11973
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
加藤 治 (勝俣治) 日本大学, 松戸歯学部, 准教授 (70349968)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 唾液腺 / 耳下腺 / 分泌顆粒 / 顆粒成熟 / 膜ドメイン / 質量分析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
若年期から発症する１型糖尿病は，膵臓β細胞の破壊によるインスリンの減少を原因とする疾患で，早期の遺伝子治療の適応が望まれる疾患の１つである。遺伝子治療を行うにあたり，膵臓自体が破壊されているためインスリンを他の臓器から分泌させる代償臓器が必要となる。その代償臓器の第一候補となるのが同じ分泌腺の唾液腺である。唾液腺は口腔内から導管を介してアプローチが可能であり，血液側への内分泌経路の存在も明らかとなっている。そのため，代償臓器としての利点を兼ね備えた器官といえる。さらに，唾液腺にインスリンを発現させることができれば，唾液分泌と同じ様に食事時にインスリンを血中に分泌させるという理想的な分泌コントロールが可能となる。ところが，代償臓器の第一候補である唾液腺でさえ，その臨床応用までには1). インスリンの顆粒濃縮メカニズムの解明，2). 刺激依存的な分泌経路の解明，3). 唾液腺特異的な遺伝子発現法の開発という３つの大きな課題を残している。本研究では課題の一つである『唾液腺の分泌顆粒にインスリンを維持・濃縮させるメカニズム』を明らかにすることを目的とし，顆粒内容物の分析と，顆粒膜の脂質分析という２つの方向から濃縮メカニズムの解明に取り組む計画である。現在までに顆粒内への維持・濃縮機構に，分泌タンパク質自体の特別な輸送シグナルは必要ないことを明らかにした。今回の結果は第60回歯科基礎医学会，および9th FAOPS CONGRESSにて発表を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
H31年度は分泌タンパク質の維持・濃縮機構に分泌タンパク質が有する輸送シグナルが必要であるかどうかについて検討した。注目したのは内在性のリソソーム酵素であるカテプシンＢである。カテプシンＢの前駆体であるプロカテプシンＢはゴルジ体でリソソーム輸送シグナルであるマンノース6リン酸（M6P）が付加されたのち，分泌顆粒からリソソームへと輸送される。そこで，『M6Pが付加されなかったプロカテプシンＢはどのような挙動を示すのか？』という疑問をもとに，M6Pが付加されなかったプロカテプシンＢが未成熟顆粒に留まりアミラーゼとともに刺激依存的に分泌されるのかどうかについて検討した。
耳下腺腺房細胞をイソプロテレノールで刺激すると緩衝液中からプロカテプシンＢが検出された。プロカテプシンＢを含む緩衝液をマンノースに結合するレクチンコンカナバリンＡ（Con A）で処理し，プルダウンアッセイを行うとプロカテプシンＢは検出されなかった。また，刺激によりアクチンやGAPDHといった細胞内タンパク質が検出されなかったことから，プロカテプシンＢが細胞の破壊によるものではなく，分泌顆粒の開口放出に結果検出されたことが示された。今回の結果は顆粒の分泌タンパク質の維持・濃縮機構が分泌タンパク質自体の性質ではないことを示しており，分泌タンパク質の顆粒維持に特別な輸送シグナルは必要ないことが示された。
一方，顆粒膜の糖脂質ＭＳ分析に関しては顆粒内容物であるアミラーゼを大量に含む分泌顆粒から脂質を分析するのが予想以上に困難であり，糖脂質はさらに微量のため適正な抽出方法は未だ見つかっていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
糖脂質分析に関して糖脂質分析を専門とする連携研究者にアドバイスを頂いたところ，分泌顆粒からの糖脂質の抽出は非常に困難を要することがわかった。MS分析を成功させるためには脂質とタンパク質の分離だけでなく，リン脂質と糖脂質を分離する工程がさらに必要で，微量な糖脂質を検出するためにどれほどの試料が必要になるかもまだわからないという状況である。そこで，糖脂質のMS分析だけではなく，通常の糖脂質分析によるアプローチを実験計画に加えるべきだと考えている。その際の問題点としては，現在，検索中の新規の膜ドメインの主な組成が判明していないことである。そのため，もう一度情報を集め，ある程度の候補を挙げて，数種類の糖脂質の検出を試みたい。また，分泌タンパク質の濃縮・維持機構の検討に関してはプロカテプシンＢの分泌実験を重ね，有意差検定を行い，分泌タンパク質自体の性質ではないことを明らかにする予定である。
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| Causes of Carryover |
ほぼ計画通りに経費を使用した。物品の割引セールや，キャンペーン価格を適応したため834円の残金が生じた。差額分を含め残りの次年度の助成金は消耗品（実験動物，顆粒分離試薬，検出抗体や試薬）の購入に使用する。
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Research Products
(2 results)
