2019 Fiscal Year Research-status Report
顆粒膜の脂質MS解析からせまる，分泌タンパク質の濃縮メカニズムの解明
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17K11973
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
加藤 治 (勝俣治) 日本大学, 松戸歯学部, 准教授 (70349968)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 唾液腺 / 分泌顆粒 / 膜脂質ドメイン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
膵臓の細胞傷害により生じる１型糖尿病は小児期に多い疾患の一つで，近い将来遺伝子治療の適応が望まれる疾患である。機能不全を起こした膵臓の代償臓器として唾液腺の適応が期待されているが，唾液分泌も未だ不明なメカニズムが多く，遺伝子治療の応用には１）耳下腺へのインスリンの発現方法の確立，２）分泌顆粒へのインスリン濃縮機構の解明，そして３）刺激依存的な血管側への分泌調節という３つの大きな課題が残されている。本研究ではそのうち分泌顆粒への分泌タンパク質の濃縮機構を解明するために，分泌顆粒の膜脂質に注目しアプローチを進めている。これまでに細胞表面と同様に分泌顆粒膜にも膜タンパク質の局在を制御している膜脂質ドメインが存在することが明らかにしており，細胞内小器官においても何らかの調節機構が存在することが示唆されている。さらに未成熟顆粒に存在するガングリオシドGM1aをメインとする膜脂質ドメインには，顆粒生成に重要なシンタキシン６やVAMP4が局在しており，そこには分泌タンパク質であるアミラーゼの抗体に反応するバンドも検出された。ところが成熟後ではシンタキシン６とVAMP4が新しい膜脂質ドメインとしてGM1aから分離されることが明らかとなった。新しい膜脂質ドメインの脂質組成は不明のため，糖脂質解析からアプローチすることで，膜脂質による顆粒膜タンパク質の分離機構，さらには顆粒の濃縮機構の解明を期待するものである。これまでの検討により非特異的な蛍光トレーサーでさえ成熟顆粒に貯留されること。あるいはリソソーム輸送シグナルであるマンノース6リン酸をもたないカテプシンＢは顆粒に貯留されるということを明らかにした。これらの結果は分泌タンパク質自体の性質は顆粒内への貯留に関与しないことを示しており，膜脂質による調節機構の存在を示唆するものであった。これらの結果は第97回日本生理学会大会にて発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
本年度の実験計画は未成熟顆粒と成熟顆粒をそれぞれ分離精製し，糖脂質分析を比較することであった。これまでに分泌顆粒を精製し，脂質解析を行ったことがある。ところが分泌顆粒における総脂質のうち多くはリン脂質であり，糖脂質はごく少量のため糖脂質の検出ピークがリン脂質の大きなピークに重複してしまい糖脂質を検出することができなかった。そこで，顆粒膜の総脂質からリン脂質と糖脂質とを分離し，分析を行う計画を立てた。実験を遂行する前に脂質分析実験には数多くの実験動物を使用する必要があるため，糖脂質分析を行う前にもう一度イソプロテレノール投与５時間後に生成される分泌顆粒が未成熟顆粒の特徴を有しているかどうかを確認することにした。そしてイソプロテレノール投与２時間後に顆粒の枯渇に伴いアミラーゼ比活性が著しく低下すること，投与5時間後の顆粒の総量は少なく，直径が小さいことも確認した。ところが精製分泌顆粒より膜画分を分離し，シンタキシン６とVAMP4の比較を行ったところ，ウェスタンブロッティング法により全くバンドが検出できないとう状況が続いた。タンパク濃度の再検討，抗体の新規購入，ブロッキングの再検討により，なんとかバンドが検出できるまでに至ったが，現在，成熟顆粒と未成熟顆粒の成熟度の再確認を続けているところである。一方，脂質分析のための条件検討は分泌顆粒より糖脂質の分離条件を検討していたが，こちらも思うように分離条件が決定していない。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度は分泌顆粒の糖脂質の分離条件を決め，少なくとも期間中に糖脂質解析までは行いたいと計画している。分離条件の検討は研究協力していただいている脂質分析の専門科の先生にゆだねられているが，それまでにスムーズな解析のため未成熟顆粒と成熟顆粒を十分量精製しておく。さらに，顆粒膜上に存在する膜脂質ドメインの機能に注目し，膜脂質ドメインを生成するための糖脂質合成酵素に注目し，阻害剤を用いた分泌顆粒成熟過程への影響を検討する。GM1aをメインとする膜脂質ドメインから別の新たな膜脂質ドメインが分離されるため，GM1aからGD1aを合成するシアル酸転移酵素ST3GalⅡを一つの候補として検討する。これには抗体がいくつか市販されているため，分泌顆粒の膜画分を用いてウェスタンブロッティング法にて行う。検出できた場合は分泌顆粒の膜脂質ドメインをショ糖密度勾配超遠心により分画し，GD1aの分布を検討し，シンタキシン6の局在との関係を精査する。また，成熟機構における糖脂質の役割を確かめるために，糖脂質の原料であるセラミドの合成阻害剤であるフモニシンB1，あるいはシアル酸転移酵素の阻害剤を用いて顆粒成熟への影響を検討する。ここではラット耳下腺腺房細胞の初代培養細胞を用いることにより，全身への悪影響を排除し，顆粒形成，あるいは成熟過程における膜脂質ドメインの役割を検討したいと計画している。
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| Causes of Carryover |
当初の予定では本年度は精製顆粒より脂質を抽出し，リン脂質と糖脂質とを分離後，MS解析を行う予定であった。しかしながら，イソプロテレノール投与5時間後に分離される分泌顆粒が未成熟顆粒であることを再確認しようとしたところ，予想外にウェスタンブロッティング法によるシンタキシン6の検出がうまくいかず，本年度中にMS解析まで行うことができなかった。そのため15万円ほどの残金がでてしまった。次年度の助成金は消耗品（実験動物，顆粒分離試薬，脂質合成酵素阻害薬，各種抗体，実験器具）の購入，および人件費に使用する。
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Research Products
(2 results)
