2018 Fiscal Year Research-status Report
エナメル質形成におけるTGF-β１の役割と機能解明
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17K11975
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| Research Institution | Tsurumi University |
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Principal Investigator |
朝田 芳信 鶴見大学, 歯学部, 教授 (20184145)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山越 康雄 鶴見大学, 歯学部, 教授 (20182470)
山本 竜司 鶴見大学, 歯学部, 学内講師 (20410053)
唐木田 丈夫 鶴見大学, 歯学部, 講師 (40367305)
小林 冴子 鶴見大学, 歯学部, 助教 (90804534)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | エナメル質 / 幼若エナメル質 / エナメルタンパク質 / 生理活性物質 / TGF-β / アメロゲニン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、歯牙発生や形成において重要な役割を担う生理活性物質の一つであるトランスフォーミング成長因子ベータ(TGF-β)に注目し、エナメル質形成におけるこの物質の役割と機能を解明することを目的とする。複雑なTGF-βの動態を理解することを通じ、歯牙硬組織形成のメカニズムに知見を得るとともに、新たな歯科再生医療技術の構築を目指すものである。
我々はこれまでにブタ幼若エナメル質中に含まれるTGF-β１のタンパク質動態について検証を行ってきた。エナメルマトリックス内に潜在型として合成分泌されるTGF-β１は基質形成期にエナメルプロテアーゼであるエナメリシン（MMP-20）によって活性化され、成熟期にはカリクレイン４（KLK4）によって不活性化されることを明らかとした。さらに興味深いことに、エナメルタンパク質を生化学的手法で特徴付け細分画化すると、TGF-β１とアメロゲニンの分解産物がいつも同じ画分に検出された。我々はTGF-β１がアメロゲニンと結合し複合体となることでその活性を維持している可能性について検討した。in vivo実験ではELISAを応用し、特異的抗体を用いた方法でアメロゲニンとTGF-β１の結合状態を証明することが出来た。また、in vitroではHPLCを用いて分離精製したアメロゲニン断片にリコンビナントTGF-β１を結合させる実験を行った。すると、各種アメロゲニン断片の中でも特にP103アメロゲニンが最もTGF-β１と結合しやすいという結果を得た。
TGF-βはレセプターであるTGFBR1に結合しリン酸化によるシグナル伝達を行う。エナメルマトリックス内で我々が注目しているTGF-β―アメロゲニン複合体もまた、エナメル芽細胞膜上に存在するTGFBR1に結合することを明らかとするため、時間分解蛍光・蛍光共鳴エネルギー転移法（TR-FRET）による実験を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
エナメルマトリックス内におけるTGF-β１のタンパク質動態について、その活性化および不活性化の機序について明らかとし、さらにアメロゲニンと複合体を形成し活性を維持している可能性を見出すことが出来た。この仮説についてin vitro 及びin vivoの両面から検証を行い、一定の知見を得ている。TGF-β1及びTGFBR1の組織学的観察であるが、ブタ顎骨歯胚での観察は困難であったため、マウスやラットで行われている文献より情報を収集した。それをもとにブタ幼若エナメル質よりエナメル芽細胞膜上に存在するTGFBR1の精製を行った。TGF-β―アメロゲニン複合体がTGFBR1に結合することを証明するため、TR-FRETによるリン酸化酵素アッセイの実験を行っている。上記のことより、平成30年度は研究計画書に示したことがおおむね計画通りに進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
TGF-β―アメロゲニンが複合体としてエナメル芽細胞膜上に存在するTGFBR1に結合することを証明するため、TR-FRETによるリン酸化酵素アッセイの検討を行う。これらの結果より、エナメルマトリックス内におけるTGF-β１のタンパク質動態についてまとめる。報告の方法として国際学会での発表および学術雑誌への投稿を予定している。
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| Causes of Carryover |
当初購入を予定していた組織学的観察のための器材購入費が少なく済んだこと、また、TGFBR1精製に動物サンプルを使用しているため入手までに時間を要し、次年度に使用が生じた。追加実験として上記に示したTR-FRETによるリン酸化酵素アッセイの実験を行う予定であり、この実験のための準備としてブタ幼若エナメル質からTGFBR1を精製するための各種検出キット、HPLCに必要なカラムおよび緩衝液作製など、主に消耗品購入の費用が必要となる。さらに、研究発表のため、雑誌投稿費や学会参加費の使用を予定している。
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Research Products
(1 results)
