2019 Fiscal Year Research-status Report
Development of the new regenerative medicine technique by applying the mechanism of the cytoskeleton reorganization.
| Project/Area Number |
17K11998
|
|---|
| Research Institution | Aichi Gakuin University |
|---|
Principal Investigator |
西田 英作 愛知学院大学, 歯学部, 講師 (10512519)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
相野 誠 愛知学院大学, 歯学部, 招へい教員 (20572811) [Withdrawn]
神谷 洋介 愛知学院大学, 歯学部, 助教 (70572808)
後藤 久嗣 愛知学院大学, 歯学部, 助教 (10783037)
小林 周一郎 愛知学院大学, 歯学部, 招へい教員 (80750190) [Withdrawn]
齋藤 正寛 東北大学, 歯学研究科, 教授 (40215562)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | 歯槽骨再生 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
NEBL(Nebulette)は、先行研究にてヒト歯槽骨由来骨芽細胞(human alveolar bone osteoblastic cell: HAOB)の採取、培養方法を確立した際に、HAOBに特異的に 発現していることが明らかになったアクチン結合タンパクであり、申請者らは、このNEBLを骨分化能力維持に関わるキー分子として注目している。このNEBLは、 HAOBを歯周病患者に移植し歯周組織再生療法を行う際の、新たな骨分化マーカー、細胞品質管理マーカーとなる可能性がある。しかしNEBLは骨分野においての研 究報告は皆無で、その機能は骨分化カスケードにおいて不明である。本研究はNEBLについて分子生物学的解析を詳細に行い、その骨分化における機能を明らかに し、細胞移植治療時に使用できる、骨分化能力を維持できるサプリメント、創薬となりうるか基礎的研究を行うことを目的とする。 NEBLが発現低下する継代回 数にNEBLリコンビナントタンパクをMAOBに添加し、NEBLの発現もしくは骨分化能力がレスキューされるか、または骨分化カスケードにおいてどのような機能を 担っているか、解析するために以下の研究計画、実験方法を以下3項目に示す。1、MAOBの採取、培養。2、MAOBにおけるNEBL発現確認。 3、MAOBにおけるNEBL添 加による骨分化カスケード関連因子の発現解析(遺伝子レベル)。4、MAOBにおけるNEBL添加による細胞骨格再編機能、骨分化カスケード関連因子の発現解析(タン パクレベル)に目的をわけ、研究を遂行していく。 平成29年度は1、2の項目について実験を予定していた。1に関してはMAOBの採取、初代培養は成功した。2に関 しては継代培養、RNA抽出の条件を検索した。平成31年（令和1年）度は3.4の項目について、検討した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成29年度は「MAOBの採取、培養を行い、それぞれの継代回数で骨芽細胞分化誘導実験を行い、NEBLが最も顕著に発現低下し始める継代回数を解明する」と研究 計画していた。先行研究では中高齢者の歯槽骨よりHAOBを培養したことから、50週齢以上のC57BL/6Jマウス3匹の下顎からaged MAOBを培養することにも成功し た。MAOBは現在7種類をそれぞれ3フラクション、2継代で凍結している。平成30年度は「NEBLの、MAOBにおける活性化および抑制する機構、細胞骨格再編機能を 予測し、機能解析を行う」ことを目標としていたが限りあるprimary培養細胞を使用する前に、まずはマウス骨芽細胞株Kusa-A1細胞を使用して手技の確認をおこ なった。Kusa-A1細胞をD-MEM培地と骨分化誘導培地で7日間培養し、骨関連遺伝子を含めNEBLの発現確認を行なったところ、骨分化誘導培地で培養したKusa-A1細 胞は骨分化後期に関連する遺伝子群の発現が上昇し、NEBLの発現は見られなかった。しかしながらD-MEM培地で培養したKusa-A1細胞のNEBL発現もわずかであっ た。以上の結果から、実験手技の確立はできたため、MAOBを骨分化誘導培地で培養し、遺伝子発現を確認していく。 平成31年（令和1年）度は、NEBLマウスリコンビナントの物品確保についてはマウス型が入手困難のためヒト型を使用する予定であった。しかしながら、理由は不明だが一旦凍結するとMAOBが成長しない現象が起こり、メディウム等ロットチェックに時間を要している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
NEBLの、MAOBにおける活性化および抑制する機構、細胞骨格再編機能を予測し、機能解析を行うため、NEBL遺伝子発現に関する手技の確立はできたため、MAOBを 骨分化誘導培地で培養し、遺伝子発現を確認していく。NEBLマウスリコンビナントが購入できない場合は、強発現実験ではなく、ノックダウン実験も視野に入れ て研究計画を練り直す。MAOBを骨分化誘導培地で培養し、遺伝子発現を確認していくには、培養期間を7日と限定せず、1、3、5、7とタイムコースを振って それぞれのRNAを回収し、解析を行なっていく予定であったが、理由は不明だが一旦凍結するとMAOBが成長しない現象が起こり、メディウム等ロットチェックに時間を要しており、計画より進行がやや遅れている。
|
| Causes of Carryover |
研究はやや進行が遅れている、かつ研究代表者と比較して、学内分担者の使用額が少なかったために、未使用額が生じた。次年度は、再度申請書類を見直し、計画どおりに研究を遂行する予定である。また、英語論文に研究成果をまとめる予定であるので、その投稿料にも充てる予定である。
|
Research Products
(2 results)
