2017 Fiscal Year Research-status Report
口腔バイオフィルムによる動脈硬化誘発機序の解明ー菌種の多様性が導く病原性ー
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17K12015
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
長田 恵美 鹿児島大学, 医歯学域附属病院, 講師 (00304816)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
於保 孝彦 鹿児島大学, 医歯学域歯学系, 教授 (50160940)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 口腔細菌 / 内皮細胞 / サイトカイン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒト歯垢は約700の菌種から構成されるバイオフィルムである。口腔細菌が感染源となって心臓脈管系疾患を引き起こすことが臨床的に報告されており、口腔衛生の重要性が注目されている。菌種の多様性がもたらす病原性を証明するために、多様な菌種の混合体として唾液から回収した口腔細菌集合体を、単独の細菌としてStreptococcus mutans Xc を用いて、ヒト動脈内皮細胞（HAEC）を殺傷しない条件下でサイトカイン産生誘導能を検討した。
HAECを5% CO2下でHumedia-EG2培地を用いて口腔細菌集合体あるいはS. mutans XcとMOI=1で4時間共培養した。次に抗生剤 (ゲンタマイシンおよびペニシリンG) 処理によりHAEC表面に付着した菌を死滅させ、細胞内に侵入した菌は生存できる状態にして、さらにHAECを24時間培養した。4時間共培養後および抗生剤処理して24時間培養後にそれぞれの培地を回収し、培地中のIL-6、IL-8、MCP-1タンパク量をELISA法で定量した。結果は非刺激HAEC(対照) と比較し、統計分析(一元配置分散分析の後、Dunnett検定)を行った。
HAECと口腔細菌集合体を4時間共培養、あるいは4時間共培養後に抗生剤処理して侵入した菌は生存できる状態で24時間培養した場合、HAECは有意に多くのIL-6、IL-8、MCP-1を産生した (P＜0.05)。一方、この実験条件ではS. mutans XcはHAECからサイトカイン産生を誘導しなかった。
口腔細菌集合体はHAECにおけるIL-6、IL-8、MCP-1産生を誘導し、その能力は単独の口腔細菌よりも高かったことから、菌種の多様性がサイトカイン産生誘導能の高さに関与している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
口腔細菌の菌種の多様性が導く病原性のメカニズムを解明するために、１年目は、単独の口腔細菌よりも多様な菌種の口腔細菌の複合体の方が炎症誘発能が高いことをヒト動脈内皮細胞におけるサイトカイン産生誘導能において検討した。その結果として、多様な菌種の口腔細菌の複合体は単独の口腔細菌よりもサイトカイン産生誘導能が高いことが証明できたので、研究課題の進捗状況はおおむね順調に進展しているとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は以下の方策で菌の増殖能、菌のヒト動脈内皮細胞(HAEC)への侵入能、菌刺激時のHAECのパターン認識受容体発現を検討することを予定している。
菌の増殖能：口腔バイオフィルム細菌を、それぞれ単独あるいは共存した状態で、5% CO2下でHumedia-EG2培地にて培養する。一定時間後Mitis-Salivarius(MS)寒天培地に播種し、48時間嫌気的に培養し、菌のコロニー数を計測する。コロニー形態で菌種の区別が困難な場合は、リアルタイムPCR法でそれぞれの菌のDNA量を相対評価する。
菌のHAECへの侵入能：HAECを一定時間、菌で刺激した後、培地を除去し、HAEC表面に存在する菌は抗生剤で処理する。HAECを0.1% Tween 20で破壊し細胞内に侵入した菌を回収、MS寒天培地にて嫌気的に培養する。48時間後に菌のコロニー数を計測し、HAECに侵入した菌数とする。
菌刺激時のHAECのパターン認識受容体発現： 菌刺激時のHAECのTLR2およびNOD2 mRNA量をリアルタイムRT-PCR法で定量し、非感染HAECおよび単独の菌で刺激したHAECの場合と比較する。
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| Causes of Carryover |
今年度は試薬やプラスッチック製品などの消耗品への支出が予定よりも少なかったため、次年度使用額が生じたと考えられる。次年度はこれを消耗品用に繰り越して使用する計画である。
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