2017 Fiscal Year Research-status Report

放射線誘発DNA二本鎖切断での53BP1 repositioningの分子機構

Research Project

Project/Area Number	17K12821
Research Institution	Sasaki Foundation
Principal Investigator	磯野真由公益財団法人佐々木研究所, 附属研究所, 研究員(移行) (90713511)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	DSB修復経路 / 53BP1 repositioning / ATR活性
Outline of Annual Research Achievements	放射線誘発DSBに集積する53BP1は、様々な修復関連タンパクをDSB部位へ集積させ、修復シグナルのカスケードを増強するための基盤となる分子である。また、G2期において53BP1はNHEJを促進しHRを抑制することから、DSB修復経路選択にも関わると考えられている。しかし、53BP1がどのようにNHEJやHRの経路選択に影響を及ぼすかについては、その詳細な制御機構は未だ明らかになっていない。本研究ではHRの進行に必要なステップである53BP1 fociの再配置（53BP1 repositioning）の分子機構を明らかにし、DSB修復経路選択における53BP1の役割を解明しようと試みている。平成29年度は、HRの開始起点となるDNAの削り込み（DSB-end resection）の進行に伴ってATM活性からATR活性へ移行することに着目し、53BP1 repositioningとATR活性の関係性について検討を行った。照射後2時間の細胞にATR阻害剤を未添加あるいは添加し、照射後4時間におけるG2期の53BP1 repositioningを検出した。ATR阻害剤の未添加では53BP1 repositioningの残存が確認出来たのに対し、ATR阻害剤を添加した細胞では53BP1のfoci自体が消失していた。このことから、53BP1 repositioningの進行はATR活性によって制御されていることが示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 53BP1 repositioningの制御にATR活性が寄与していることを示す結果は得られたが、今年度実施予定であった超高解像度顕微鏡を用いた実験が研究代表者の所属機関の変更により困難になってしまったため。
Strategy for Future Research Activity	次年度は、ATR阻害剤添加に対する53BP1 repositioningの消失について、より詳細な検討を行う。53BP1 repositioningの制御に寄与するBRCA1やPP4C、CtIP、クロマチンの構造変換に機能するSMARCAD1やTIP60、CSBそれぞれをノックダウンした細胞を用いて、53BP1とその上流であるγH2AX、MDC1、53BP1がDSB部位に集積する際に認識するヒストン修飾（メチル化およびユビキチン化）に着目し、照射後2時間におけるATR阻害剤添加した場合の上記タンパクの集積または修飾への影響はあるのか、免疫蛍光染色を行い検討する。また、53BP1がrepositioningしている状態での、53BP1の維持にRNF168が必要かどうかを検討するため、RNF168タンパク質を一過性に低下させるRNF168-AID発現細胞を樹立する。さらに、平成30年度の研究実施計画に記載した53BP1 repositioningとDSB-end resection（以後、resection）の関係性についての実験を実施する予定である。照射後2時間でのATR阻害剤添加に伴う53BP1 fociの消失によってresectionのマーカーであるRPA fociは過度のresectionにより大きくなるのか、それとも影響がないのか、または消失するのか、免疫蛍光染色を行い検討する。これらの実験から、53BP1 repositioning、すなわちDSB修復シグナルの基盤がHR修復時ではATR活性に依存しているか、またクロマチンの構造に依存しているのかどうか明らかとなる。超高解像度顕微鏡を用いた実験については、一時中断し、実験の進行具合をみて共同研究者である群馬大学柴田淳史研究講師と相談して実施するかを判断する。
Causes of Carryover	平成29年度に超高解像度顕微鏡を用いた実験用にカバーガラスとスライドガラスを購入する予定であったが、所属機関変更に伴い超高解像度顕微鏡を用いた実験が困難になったため、未使用額が生じた。このため、通常の免疫蛍光染色による解析を精力的に次年度行うこととし、未使用額はその経費に充てることととしたい。