パーキンソン病原因因子DJ-1が、酸化環境のセンサーとして働くメカニズム

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K13258
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 加藤 いづみ 北海道大学, 薬学研究院, 助教 (40634994)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 酸化ストレス / DJ-1 / 分子間相互作用 / パーキンソン病 / 癌 / p53

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではDJ-1が酸化価数ごとに相互作用因子を変えて、酸化ストレス後の神経細胞死を制御していると予測して、各酸化価数のDJ-1や恒常的酸化型DJ-1のp53結合能や神経細胞内挙動を調べることにより、パーキンソン病の発症原因である神経細胞死におけるDJ-1の司令塔としての役割の解明を行う。
これまで、還元型DJ-1のモデルには、DJ-1の106番残基をCysからSerへ置換したDJ-1C106Sが広く使われていた。本研究ではDJ-1 Cys106の酸化価数の変化が相互作用因子の選択に重要であると予測し、研究を進めている。相互作用因子はCys106周辺を認識していると予想されるため、Cys106以外の残基に変位を入れた、還元型DJ-1のモデルを作成することにより、Cys106の酸化価数に起因した結合変化を明らかにすることができる。Cys106のSH基が酸化されない恒常的還元型DJ-1変異体は、酸化部位であるCys106以外の残基に変異をいれることで、前年度までに作成した。さらに、恒常的酸化型DJ-1は予備実験にて、作成済みである。今回は、これら変異体および酸化処理を行った野生型DJ-1とp53の相互作用解析を、結合に必要であることを前年度に見出した補因子存在条件下で、ゲル濾過クロマトグラフィーと表面プラズモン共鳴装置を用いて行った。その結果、補因子存在下で不安定化していたp53が、DJ-1と共存することで、安定化することを見出した。さらにp53とDJ-1の結合に必要な補因子の至適濃度の検討を詳細に行った結果、DJ-1とp53の結合親和性が補因子存在下で、増すことを明らかにした。また、恒常的酸化型DJ-1、恒常的還元型DJ-1の細胞発現系用プラスミドを作成し、各酸化型DJ-1の神経細胞内局在観察や各酸化型DJ-1の神経細胞死抑制機能解析のための、アッセイ系を構築している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

用量依存的に、DJ-1がp53と結合すること、その結合が還元型DJ-1モデルでは起こらないことを、表面プラズモン共鳴装置を用いて、明らかにした。この結合は、補因子存在下で起こり、そのことから、DJ-1の酸化価数に応じたタンパク質結合能の変化に、新たなファクターが必要であることを示せた。KDの算出が可能な表面プラズモン共鳴法で、酸化価数の異なるDJ-1モデルとp53結合能を比較できたことは、本研究の主要な目的の一つであるDJ-1の酸化価数変化に伴うタンパク質結合能の変化を解析することに向け、研究が大きく前進したと言える。さらに、各DJ-1酸化状態モデルの細胞発現系用プラスミドを作成し、神経細胞内局在観察や各酸化型DJ-1の神経細胞死抑制機能解析のための準備も進んでいるため、概ね順調に進んでいると言って良い。

Strategy for Future Research Activity

2019年度はDJ-1酸化価数の変化が、DJ-1機能を変化させる機構を、細胞レベルで明らかにしていく。前年度から作成を進めていた各DJ-1酸化状態モデルの細胞発現系用プラスミドを使用して、各酸化型DJ-1の神経細胞内局在観察や各酸化型DJ-1の神経細胞死抑制機能解析を行う。DJ-1とp53の結合ピークは酸化剤添加後、30分と早くに訪れ、その後、結合は解離することを明らかにしている。このことから、DJ-1は酸化ストレスに早急に応答し、過剰ストレス下では機能を失うことが予測される。そこで、神経細胞内の局在観察においては、局在をタイムラプスで観察する予定でいる。これにより、DJ-1がストレスセンサーとして応答し、その後、機能を失うまでを観察できると考えている。その他、各酸化型DJ-1の神経細胞死抑制機能はMTS assayにて解析する。DJ-1は、酸化ストレス条件下で細胞死を抑制する。しかしながら、細胞死抑制にDJ-1と共に働く、各酸化価数特異的なDJ-1結合因子は不明である。そこで、恒常的酸化型DJ-1モデルをDJ-1ノックアウトドパミン作動性神経細胞へ導入して、免疫沈降実験を行い、恒常的酸化型DJ-1結合因子を同定する。これにより、酸化ストレス後の神経細胞死抑制に関与するDJ-1結合因子を同定する。

Causes of Carryover

当初、本研究に使用している一部の機器がオープンファシリティ化することに伴い、機器使用料金が発生する予定であった。しかしながら、オープンファシリティ化の開始時期の変更に伴い、機器使用料金が不要となった。また、DJ-1結合因子同定に予定していた試薬を次年度購入としたことからも次年度使用額が生じた。
次年度使用額の使用計画には、神経細胞内局在観察や神経細胞死抑制機能解析を行うために使用する各種試薬を購入し、DJ-1機能を変化させる機構について、細胞ベースでの研究を精力的に進めたいと考えている。また、開始が延期されていた、本研究に使用する一部の機器のオープンファシリティ化に伴い、機器使用料金が発生する。この使用料金にも予算を充てていく予定である。