2020 Fiscal Year Research-status Report

パーキンソン病原因因子DJ-1が、酸化環境のセンサーとして働くメカニズム

Research Project

Project/Area Number	17K13258
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	加藤いづみ北海道大学, 薬学研究院, 助教 (40634994)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2022-03-31
Keywords	パーキンソン病 / DJ-1 / 酸化ストレス
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、パーキンソン病原因因子DJ-1が酸化ストレスレベルに応じて、酸化価数を変化して、神経細胞内の酸化度を感知するストレスセンサーとして働き、酸化ストレスレベルに応じて、相互作用因子を変化することで、神経細胞死の抑制に働くと予測。酸化ストレスレベルに応じたDJ-1の活性化機構と、DJ-1の価数変化に伴う構造変化や細胞内の挙動を分子レベルから明らかにするものである。これまで、DJ-1が酸化ストレス後の神経細胞死を抑制すること、また、多くのDJ-1相互作用因子が報告されている。これら相互作用因子の中には、酸化ストレスにより、DJ-1との結合量が増加するものが多く含まれる。しかし、酸化ストレスによる細胞死の抑制にDJ-1と共にはたらく各酸化価数特異的な結合因子は不明である。前年度までに結合因子探索に使用する各酸化型モデルのDJ-1変異体を作成し、各酸化型DJ-1による細胞死抑制への効果を、MTSアッセイを用いて測定してきた。さらに、各酸化型特異的結合因子を探索するための質量分析では、waters AQUITY UPLC/Xevo G2-S Q Tofを使用して解析を行うため、コントロールサンプルを用いて、pmolオーダーまで同定可能な状態に機器を調整済みである。今回は、前回に引き続き、各酸化型モデル特異的DJ-1変異体をDJ-1ノックアウトドパミン作動性神経細胞へ導入し、プルダウン実験を行って、恒常的還元型DJ-1特異的結合因子のバンドが複数得られたため、現在質量分析計を用いてそれら結合因子を解析中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason DJ-1ノックアウトドパミン作動性神経細胞SH-SY5Y細胞抽出液へ恒常的酸化型DJ-1タンパク質、もしくは恒常的還元型DJ-1タンパク質を添加し、プルダウン実験を行った。その結果、恒常的酸化型DJ-1タンパク質に、特異的に結合する因子が複数確認された。また、これに加え、恒常的還元型DJ-1特異的に結合する因子も確認された。当研究院で保有している高感度で測定可能なwaters AQUITY UPLC/Xevo G2-S Q Tofを用いて、判定を行うために、より高容量の結合因子を獲得するためアッセイ系を再構築している。しかしながら、コロナウイルス感染症による緊急事態宣言により、4-5月の間、自宅での待機を行わねばならなかったこと、また、緊急事態宣言解除後も、在宅勤務を挟みながらの勤務となったため、研究室での実験が大幅に遅延した。このため、期間を延長して、研究を行う。
Strategy for Future Research Activity	2021年度は、2020年度に引き続き、酸化ストレス処理後、プルダウン実験を行い、各酸化型DJ-1特異的結合因子同定を進める。当初、酸化型DJ-1特異的因子同定を目的として行ったプルダウン実験であったが、酸化型DJ-1特異的結合因子に加え、恒常的還元型DJ-1特異的結合因子も確認された。これは、DJ-1が酸化ストレスにより結合をかい離することで機能を変化させる因子が存在することを示唆している。恒常的還元型DJ-1結合因子探索には、酸化ストレス処理を行わないSH-SY5Y細胞抽出液へ変異体タンパク質を添加して、プルダウン実験を行うことにより、質量解析に必要な高容量の結合因子獲得を目指す。
Causes of Carryover	新型コロナウイルス感染症発生に伴う、4－5月の緊急事態宣言の期間、自宅での待機を避けられない状況であった。加えて、緊急事態宣言解除後も、在宅勤務を交えながらの勤務体型が必要となった。このため、研究室で実験を行える期間が大幅に減少した。また、予定していた学会への参加がオンライン開催となったことに伴い、旅費の必要がなくなった。次年度において、質量分析用試薬を購入すると共に、オープンファシリティ化に伴い、発生している解析機器の使用料にも予算を使用する。