2018 Fiscal Year Research-status Report
L-DNA/SNA回路の設計と細胞内RNAの高感度・高正確検出
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17K14514
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
村山 恵司 名古屋大学, 工学研究科, 助教 (70779595)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | DNA / L-DNA / 直交性 / 増幅回路 / RNA検出 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、天然には存在しないL体のDNA (L-DNA)を用いることで、天然のD-DNAやD-RNAと非特異な反応を起こさないL-DNA回路を構築することを目的とする。すなわち、人工核酸SNAを媒介として、天然のD-RNA配列情報をL-DNAシグナル増幅回路に伝達させることで、細胞内RNAの高感度・高正確な検出を目指す。
本年度は、標的RNAに応答してL-DNAのInputシグナルを放出するSNAインターフェイスの再設計・最適化を行った。昨年度まではL-DNAとSNAを別々の鎖で設計していたため結合力が弱く、非特異的なL-DNA-Inputの放出が問題となった。そこで、SNAとL-DNA-Inputを連結させる設計に変更した。この設計においてはSNA/L-DNA-Input二重鎖が分子内で形成されるため、非特異的な解離が抑制される。また、標的との結合によりL-DNA-Inputが一本鎖に解離してもSNAと連結されているため、標的の位置特異的に回路を作動させることができ、よりイメージングに適していると考えられる。結合部の長さが異なるSNA/L-DNA-Inputコンジュゲートを作成し機能評価を行った結果、結合部が16塩基対の場合において、標的非存在下でSNA/L-DNA-Input二重鎖を形成し、標的添加によりL-DNA-Inputが一本鎖に解離する様子が確認された。このことから、新たな設計のSNA/L-DNA-InputコンジュゲートがRNAシグナルをL-DNAシグナルへと変換できることが示された。次に、増幅回路側の検証も行った。モデルとしてD-DNAを用いて、Inputに応答するHCR回路を設計した。配列長を様々検討した結果、stemとloop(toehold)それぞれ8残基の場合に効率のよい蛍光シグナル増幅が見られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
設計の変更はあったが、最終的にSNAとL-DNA-Inputを連結させることで標的RNAに特異的に応答してL-DNA-Inputシグナルを発生させるシステムが構築できた。また、増幅回路の検証実験にも成功しており、研究は計画通りに進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
D-DNAで検証した配列設計を用いて、L-DNA増幅回路を合成する。SNA/L-DNA-InputコンジュゲートとL-DNA増幅回路を系中で混在させ、標的RNAからL-DNA-Inputへのシグナル変換と、それによるL-DNAシグナル増幅回路の起動を行う。つまり、標的RNAに応答し増幅された蛍光シグナルを発生できることを確認する。最終的には、細胞内や細胞抽出液中でのRNA検出を目指す。
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| Causes of Carryover |
設計変更に伴い、消耗品の購入量が予定より減少した。次年度の消耗品購入に使用し、予定していた実験をさらに充実させる。
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