2018 Fiscal Year Research-status Report
Drug Derivery to Cancer Cells Utilizing Active Trasport of Diphtheria Toxin Protein
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17K14520
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| Research Institution | Tokushima Bunri University |
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Principal Investigator |
服部 良一 徳島文理大学, 薬学部, 助教 (60778140)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 生体分子化学 / タンパク質工学 / ドラッグデリバリー / ケミカルバイオロジー / NMR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
オフターゲットによる副作用が致命的となる抗がん剤や、核酸医薬に代表される細胞膜透過性の低い水溶性の薬剤開発において、そのデリバリー制御はきわめて重要な課題となる。薬剤に細胞特異性および細胞内導入能を付与するため、本研究では、受容体介在型エンドサイトーシスによって細胞内に侵入したのち、エンドソームから細胞質へ移行するジフテリア毒素タンパク質に着目した。ジフテリア毒素と薬剤・生体高分子を化学的あるいは遺伝子的に連結することにより、その生物学的機能を利用したデリバリーシステムを開発する。さらには、ジフテリア毒素の受容体結合ドメインを別種の受容体リガンドに置換することで、細胞特異性の制御を可能にする。なお、ジフテリア毒素の細胞毒性は無毒化された変異体を用いる、あるいは毒性の原因となる酵素ドメインを遺伝子的に欠失させるため、問題とならない。
平成29年度は、ジフテリア毒素タンパク質の無毒変異体CRM197を蛍光標識し、ジフテリア毒素感受性が高いVero細胞への高効率な細胞内導入が観察された。蛍光標識はヨードアセトアミド誘導体を用いることで、細胞質に移行する酵素ドメイン中のHis21選択的に付加させることができた。さらに核酸医薬への応用を目標として、オリゴDNAとCRM197のクロスリンク体を合成することに成功した。
平成30年度は、酵素ドメインを欠失した大腸菌組換え発現系を各種構築した。酵素ドメインをGFPに置換した融合タンパク質の場合は、CRM197の場合と同程度にGFPが細胞内に導入された。つぎにユビキチンに置換した場合は、細胞内のユビキチンC末端加水分解酵素によって、高効率にユビキチンがジフテリア毒素から遊離して細胞質に移行した。さらに、ジフテリア毒素とジスルフィド結合によって連結した蛍光分子やGFPの細胞内導入にも成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ジフテリア毒素の無毒変異体CRM197を用いた系については、細胞質に移行する酵素ドメイン中のHis21選択的な化学修飾反応を応用した。この手法はオリゴ核酸にも適用が可能であった。すなわち、CRM197を薬剤の輸送体として用いる基盤技術が確立したといえる。さらに、酵素ドメインを欠失した組換えタンパク質を、3種の指針に基づいて設計し、すべてにおいて細胞内導入および細胞質移行を可能にした。
1つ目に、毒性を示しうるジフテリア毒素1-172を欠失させてGFPに置換した融合タンパク質を作製した。これはジフテリア毒素の酵素ドメインがエンドソームから細胞質に移行する際に、フーリンによるペプチド結合切断および還元的環境でのジスルフィド結合切断によって遊離する機構を利用している。これによって、酵素ドメインを欠失したジフテリア毒素と融合したGFPが細胞内で遊離し、細胞質へ高効率に移行されることが示された。2つ目にはジフテリア毒素1-202を欠失させ、薬物を化学修飾するためのシステイン変異を導入したユビキチンに置換した。さらにユビキチン結合性タンパク質との相互作用面にあるアミノ酸へ変異を入れ、細胞内で効率よく拡散できるように設計した。この場合では、ユビキチンC末端加水分解酵素によってユビキチンはジフテリア毒素から遊離し、実際、高効率に細胞質へ移行させることができた。3つ目はジフテリア毒素1-199を欠失させ、残ったC201残基を薬剤の化学修飾部位とした。修飾反応においてはC201とジスルフィド結合によって低分子化合物やタンパク質を連結した。これらについても、細胞内導入および細胞質移行されることが示された。
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| Strategy for Future Research Activity |
ジフテリア毒素の無毒変異体CRM197を用いた系については、今後siRNAなどの機能性核酸や細胞毒性を示す抗がん剤を化学的に連結させ、細胞内導入した際の活性を評価する。低分子化合物である薬剤を連結させる上では、細胞内導入後に自発的な脱離反応によって薬剤が遊離する機能性リンカーによって連結させる。これによって、細胞内で薬剤はジフテリア毒素から遊離し、本来の化学構造となる。またこれまでの細胞実験では、ジフテリア毒素感受性が高いVero細胞（アフリカミドリザル由来）を用いていたが、ヒト由来の細胞株を用いた場合に同等の導入効率を示すかどうかを検証する。その細胞株として、ジフテリア毒素受容体の発現量が高いものと平常レベルのものを用いて比較する。
組換え発現によって機能改変した系については、CRM197と同様の検討をすすめるほか、受容体結合ドメインをがん細胞に高発現する受容体リガンドに置換することで、細胞特異性を制御する。タンパク質の細胞内導入においては、その細胞内動態制御のために各種局在化シグナル配列を付加し、薬剤標的が存在する細胞小器官へ移行させる。
本研究の発展的課題としては、あらかじめ安定同位体標識した核酸やタンパク質を高効率に細胞内導入できれば、その細胞内動態を直接的にNMR検出する「in-cell NMR法」への応用が期待される。NMR法の原理的な感度の低さによって、in-cell NMR法で可能な構造・相互作用解析は限定されている。ジフテリア毒素の機能を利用することによって、解析対象とする核酸・タンパク質の細胞内濃度を大幅に向上させることが可能となれば、当該分野における大きなブレイクスルーとなる。
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| Causes of Carryover |
平成30年度はほぼ予定額を支出した。次年度使用額は初年度（平成29年度）に繰り越したものであり、これは遺伝子組換え実験申請の関係で該当する実験の開始が遅れたためである。
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