2018 Fiscal Year Research-status Report
ヒトiPS細胞由来の分化細胞を用いた次世代環境診断システムの開発
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17K14525
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
谷 英典 国立研究開発法人産業技術総合研究所, エネルギー・環境領域, 主任研究員 (10635329)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ヒトiPS細胞 / ノンコーディングRNA / 環境センシング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ヒト人工多能性幹細胞（ヒトiPS細胞）、及び、タンパク質に翻訳されない長鎖ノンコーディングRNA（長鎖ncRNA）に着目することで、化学物質等のヒトへの直接的影響評価を可能とする、次世代環境センシングシステムの開発を目的として研究を進めた。ヒトiPS細胞は、多くの細胞に分化できる分化万能性と、分裂増殖を経ても維持が可能な自己複製能を有する細胞であり、胚性幹細胞（ES細胞）の有する倫理的な問題をクリアしており、さらに元の細胞の性質・機能を維持しているという利点を有する。また、長鎖ncRNAはタンパク質に翻訳されないRNAであり、細胞のストレス応答においてダイナミックな制御機構を担うことが近年報告され始めている。
まず我々は、フィーダー細胞を用いないヒトiPS細胞の安定的な培養法を確立した後、神経幹細胞に分化させ、本細胞にモデル環境ストレスとして、過酸化水素、塩化水銀、シクロヘキシミド、塩化亜鉛等を24時間暴露することで、暴露後RNA発現量が著しく増加する長鎖ncRNAとして、4つの新規分子を同定した。また、従来のバイオマーカーとしてストレス関連遺伝子等（mRNA）と比較した結果、長鎖ncRNAの方が高感度かつ迅速に環境ストレスに応答することを見出した。さらに、ヒトiPS細胞から分化させた神経幹細胞において、化学物質暴露により発現量が著しく増加した長鎖ncRNAについて、その応答メカニズムを解明するために、RNAの生成及び分解速度を求めた。その結果、化学物質暴露によりRNAの生成速度は変化しなかったが、RNAの分解速度が著しく遅くなることを見出した。以上より、ヒトiPS細胞において、長鎖ncRNAが環境ストレスに対するサロゲート分子として有用であることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究室において、京都大学iPS細胞研究所（CiRA）のプロトコールに従い、京都大学の山中伸弥教授らが樹立したヒトiPS細胞株（201B7）の培養を行った。フィーダー細胞としてマウス細胞株（SNL 76/7）を用いた。その後、WiCell Research Instituteのプロトコールに従い、フィーダー細胞を用いない培養法に切り替え、神経幹細胞に分化させることに成功した。続いて、モデル環境ストレスとして、様々な化学物質を暴露することで、複数の長鎖ncRNAの存在量が著しく増加することを見出した。さらに、この増加は、RNAの分解速度の抑制によるものであることを突き止めた。本結果は、今後の予定である、化学物質により発現量が増加する長鎖ncRNAの応答メカニズム及び機能解明につながる重要な知見である。
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| Strategy for Future Research Activity |
フィーダー細胞を用いないヒトiPS細胞を肝細胞に分化させ、本細胞にモデル環境ストレスとして、過酸化水素、塩化水銀、エトポシドを24時間暴露することで、暴露後RNA発現量が著しく増加する長鎖ncRNAを同定する。並行して、ヒトiPS細胞の肝細胞への分化が困難である場合に備え、ヒト肝がん細胞（HepG2）で同様の検討を実施する。化学物質暴露により発現量が著しく増加した長鎖ncRNAについて、その応答メカニズムを解明するために、RNAの生成及び分解速度を求める。これまでの我々の別の知見より、化学物質暴露によりRNAの分解速度が遅くなることが予想されるため、RNAi法を用いて主要なRNA分解酵素をノックダウンし、長鎖ncRNAの分解に関与するRNA分解酵素を特定する。続いて、同定した長鎖ncRNAに対して、RNA-Fluorescence in situ hubridization（RNA-FISH）法を行い、細胞内での局在を調べる。さらに、長鎖ncRNAに結合するタンパク質を明らかにするために、MS2 Tag等のアフィニティータグ配列を連結した長鎖ncRNAを細胞内で発現させ、RNA-タンパク質複合体の状態にした後、アフィニティータグ配列を利用したアフィニティー精製により細胞抽出液からRNA結合タンパク質を精製し、RNAと同時に精製されてくるタンパク質をマススペクトロメトリー法で同定する。また、これらの細胞に対して、蛍光顕微鏡観察を行い、細胞形態の変化、細胞核の肥大化、アポトーシス関連タンパク質の検出等を行うことで、多角的に細胞の変化を調べる。
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| Causes of Carryover |
【理由】
2018年11月1日から、所内のイノベーション推進本部 産学官・国際連携推進部 国際連携室に1年間出向（2019年10月31日まで）となり、当初予定していた研究業務を行うことが直接的に困難となったため。
【計画】
2019年11月1日から、当初予定していた使用計画書通りに研究を遂行する。
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[Journal Article] Multiplicity in long noncoding RNA in living cells2018
Author(s)
Kurokara R, Komiya R, Oyoshi T, Matsuno Y, Tani H, Katahira M, Hitachi K, Iwashita Y, Yamashita T, Kondo K, Yoneda R, Yamaoki Y, Ueda N, Mashima T, Kobayashi N, Nagata T, Kiyoishi A, Miyake M, Kano F, Murata M, Hamad N, Sasaki K, Shoji N.
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Journal Title
Biomedical Sciences
Volume: 4
Pages: 18-23
Peer Reviewed
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