2018 Fiscal Year Research-status Report

骨格筋前駆細胞分化に高度に特化した細胞外マトリックスの開発

Research Project

Project/Area Number	17K14865
Research Institution	Tokyo Institute of Technology
Principal Investigator	眞下泰正東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (20707400)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	骨格筋前駆細胞 / ナノファイバー / 細胞外マトリックス / 培養細胞足場 / 分化誘導 / 多能性幹細胞
Outline of Annual Research Achievements	骨格筋前駆細胞は、骨格筋の移植治療のリソースとして非常に重要であり、これを高効率に生産するプロセス開発が求められている。申請者は、優れた自己複製能と多分化能を有し、かつ、品質が保証されている多能性幹細胞（ES/iPS細胞）を出発細胞とし、これを分化誘導して骨格筋前駆細胞を安定かつ効率的に作製する方法確立を目指している。そこで先ず本研究では、細胞の増殖・生存・運命決定に大きな影響を与える培養細胞足場としての細胞外マトリックス開発を目的とする。平成30年度では前年度に引き続き、細胞の伸展を阻害して骨格筋細胞への成熟を抑制することを狙いとし、ファイバー状の培養細胞足場の構築を主に進めた。前年度ではコラーゲンファイバーを構築したが、本年度では、生分解性ポリマーを材料としたポリカプロラクトンナノファイバー（PCL-NF）をファイバー骨格とし、このファイバー骨格表面に細胞接着シグナルを有するタンパク質をコートしたファイバー状細胞足場の構築を試みた。具体的にはPCL-NFの作製条件の検討、骨格筋前駆細胞の増殖促進に働くことが知られるαvβ3インテグリン及び骨格筋前駆細胞分化促進能が知られるα6β1インテグリンに親和性を示す足場タンパク質の構築、足場タンパク質のPCL-NFコーティング条件の検討を行った。さらに、作製したファイバー細胞足場について細胞接着能評価、分化マーカー遺伝子の発現量を指標とした分化促進能評価を実施した。結果、作製した細胞足場において、コントロールと比較して分化マーカー発現量が有意な増加が観測された。以上より、おおむね研究計画の通り、平成30年度に細胞足場材料候補の構築を終え、さらに分化促進能を指標とし、目的に適した足場材料の選別を実施し、目的分化マーカー発現量に顕著な変化をもたらす候補を得た。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 前年度に作製したコラーゲンファイバーは、転写因子接着能、細胞接着能を示し、骨格筋前駆細胞分化の促進効果が期待された。しかし、ファイバー作製時の架橋反応が原因でナノファイバー構造が崩れており（直径が数µm、表面粗さが数～数十ナノメートル）、ファイバー構造の無い実験条件と比較し、骨格筋前駆細胞分化促進能、細胞形態にあまり大きな差異が観測されなかった。そこで、架橋反応を必要としないファイバー状の細胞足場として、ファイバー材料を生分解性の合成ポリマー（ポリカプロラクトン）に変更し、これにコラーゲンを表面コーティングして足場として利用することとした。これにより、ファイバーの作製条件の洗い出しから始めることとなり研究の遅れが若干生じた。また、上記の新たなファイバー細胞足場を採用するに伴い、研究内容に幾つかの変更を加えた。理由は、上記の足場の作製条件であればコラーゲン以外の細胞足場タンパク質を簡単に評価できるためである。ここでは、コラーゲン以外にゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、マトリゲルといった一般的に筋細胞培養足場として利用されるタンパク質、および、骨格筋前駆細胞の増殖促進が知られているαvβ3インテグリン、または、骨格筋前駆細胞分化促進が知られるα6β1インテグリンに親和性を有する足場タンパク質を、利用・構築して、それぞれをコーティングしたファイバー細胞足場を作製し、これらの分化促進能の比較も行うこととした。
Strategy for Future Research Activity	次年度では、本年度に構築した足場材料を引き続き用いて、さらに詳細な分化促進能評価を実施していく。具体的には、分化促進能に顕著な変化を示した幾つかの候補材料について、遺伝子発現だけでなくタンパク質マーカー発現の定性・定量解析を実施していくことに加え、マーカー分子の発現だけでなく骨格筋細胞への分化能を比較して骨格筋前駆細胞の総合的な品質を評価する。さらには、初年度に構築したヘリックス融合MyoD転写因子をヘリックスのヘテロ結合能を利用して足場に固定化し、骨格筋前駆細胞から骨格筋細胞への分化誘導の効率化を試みる予定である。
Causes of Carryover	本年度は材料開発が主な内容であるため、研究費の出費は比較的抑えられた。次年度は、高額な試薬や受託解析を必要とする細胞分化能評価が主な内容になるため、次年度の研究費と本年度の余剰額を含めた研究費が必要となる。