2018 Fiscal Year Annual Research Report
Development of useful compound production process focused on outer membrane vesicles and self-assembly formation in Escherichia coli
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17K14869
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| Research Institution | Osaka City University |
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Principal Investigator |
尾島 由紘 大阪市立大学, 大学院工学研究科, 講師 (20546957)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 細胞外小胞 / OMV / 外膜小胞 / 大腸菌 / タンパク質分泌 / フロック / グリセロール |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. 細胞外小胞OMVsの産生向上とタンパク質生産
前年度は，ペプチドグリカン層の構造維持に関与するnlpI遺伝子と外膜脂質の外層と内層の非対称性を高めるyrbE(mlaE)遺伝子との二重欠損株が，野生株と比較して約30倍のOMVsを産生量することを明らかにした．本年度は，二重欠損株を用いて，まずはモデルタンパク質であるGFPを発現させたところ，培地中に3.3 mg/Lの濃度で分泌可能であった．続いて，有用タンパク質であるヒトインターフェロンも同様の方法で発現させたところ，GFPと比較して大幅に濃度が低下したが約10 μg/L程度で分泌可能であることを確認した．また，OMVsによって分泌されたインターフェロンは水溶性であり，Hisタグを用いた精製も可能であったため，フォールディングが正しく行われていた．以上の結果より OMVs現象がタンパク質分泌ツールとして利用可能であることを実証した．
2. フロック形成機構の解明とその応用技術の開発
前年度は，ペリプラズムプロテアーゼをコードする遺伝子degPの欠損株で誘引される大腸菌フロックは，グリセロール添加に対して濃度依存的に形成量が増加することを明らかにした．そこで本年度はグリセロールによるフロック形成の促進機構の解明を目指した．グリセロールの培養液中への添加効果としては，基質としての利用，粘性の増加，忌避物質応答の誘引などが考えられた．まずフロック形成前後でグリセロール濃度は変化しておらず，基質として利用されていなかった．それにより培養液粘度は高いままであるため，同等の粘度を示す濃度のカルボキシメチルセルロースやポリビニルピロリドンを添加したが，フロック形成は促進されず粘度の影響ではないことがわかった．続いて，グリセロールと同じポリオールであるエチレングリコールを添加したところ，濃度依存的にフロック形成が促進された．
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