2017 Fiscal Year Research-status Report
ALSにおけるポリグルタミン凝集体結合タンパク質DDX-17異常蓄積の病態解明
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17K14956
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
多田 美紀子 横浜市立大学, 附属病院, 助教 (30722467)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | DDX17 / 小胞体 / ALS |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DDX17はDEAD box RNA helicaseファミリーに属するRNA結合タンパク質であり、遺伝子発現の多くの段階で機能し、特にmiRNAの生合成や選択的スプライシングの制御などに関与している。ALSでは、TDP-43、FUS/TLS、matrin 3をはじめとするRNA結合タンパク質が病態形成に重要な役割を担い、運動ニューロンを中心に異常蓄積すること、さらにはこれらのタンパク質をコードする遺伝子が家族性ALSの責任遺伝子であることが知られている。我々はこのDDX17も孤発性ALSの運動ニューロンに異常蓄積するという重要な知見を見いだしており、本研究ではDDX17のALSの病態への関与について、病理学的側面、分子細胞生物学的側面から検討を行い、ALSの新たな病態形成機序を明らかにすることを目標としている。
抗DDX17抗体を用いた免疫組織化学的検討を孤発性ALS剖検例14例およびコントロール症例7例の腰髄のパラフィン包埋切片で行った。抗DDX17抗体では細胞質に顆粒状に分布する所見をALS症例全例で、コントロール症例では7例中3例のみで認めた。またALS/FTLDにおける既知の細胞質内封入体構成タンパク質であるTDP-43との細胞内局在の関連性について評価するため、二重染色を行ったところ、TDP-43との共局在は認められなかった。さらに細胞質内の顆粒状蓄積が、形態学的に小胞体に蓄積している可能性が推測され、小胞体マーカーとして知られるGRP78、PDIとの二重染色を行ったところ、共局在がみとめられた。以上より、DDX17がALSでは小胞体に蓄積している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ALS症例ではコントロール症例と比較して、DDX17が細胞質にびまん性に、顆粒状に分布していることを複数例で確認することができた。
TDP-43との共局在はみられなかったが、小胞体マーカーとの二重染色で共局在を認め、小胞体に蓄積する可能性を示すことができた。
以上より、研究については概ね順調に進展しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
DDX17の凝集体形成に与える影響を検討するため、Neuro2a細胞、SHSY-5Y細胞に、ALS病因タンパク質であるTDP-43、FUS/TLSの野生型および変異体を過剰発現し、DDX17の凝集を観察する。また、逆にDDX17発現ベクターまたはsiRNAを同時にトランスフェクションし、ALS病因タンパク質凝集体の凝集速度・細胞質移行を蛍光顕微鏡で観察、定量する。また不溶性細胞分画を抽出し、ウェスタンブロット解析を行うことで凝集体の定量を行う。これらの解析により、DDX17と孤発性ALSの既知の病因タンパクとの凝集の相互関係を明らかにする。
DDX17はmiRNAの生合成に関与することが報告されており、一方で孤発性ALSの血清中においてもmiRNAの変化が確認されている。DDX17の蓄積に基づく機能障害が孤発性ＡＬＳでみられるmiRNA変化に寄与する可能性について、培養細胞を用い検討する。すなわち、DDX17の過剰発現・ノックダウン状態におけるmiRNAプロファイリングを行い、孤発性ALSで見られる変化と比較検証する。
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| Causes of Carryover |
抗体購入費用で残額が生じた。次年度にDDX-17の凝集体生成に与える影響についてNeuro2a細胞、NSC細胞を用いて検討し、さらにmiRNAの変化についても検索を予定しているため、siRNAの購入費用、培養用血清等の購入に使用する計画である。
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Research Products
(2 results)
