2018 Fiscal Year Research-status Report

ゲノム編集技術を用いたマウスのストレプトゾトシン感受性遺伝子の同定と機能解析

Research Project

Project/Area Number	17K14975
Research Institution	Nagoya University
Principal Investigator	宮坂勇輝名古屋大学, 医学系研究科, 助教 (30778098)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	マウス / ストレプトゾトシン / 糖尿病感受性遺伝子 / 膵島脆弱性 / ゲノム編集 / CRISPR/Cas9システム
Outline of Annual Research Achievements	マウス系統にはストレプトゾトシン（STZ）感受性に系統間差異が存在する。STZは膵島を特異的に破壊することから、その感受性を規定する原因遺伝子を同定することは、膵島脆弱性に起因する糖尿病発症機構の解明に繋がることが期待できる。本年度はSTZ感受性の異なるA/JとSM/J系統間に見出したMpg遺伝子のp.132Ala>Ser変異およびC3HとNSY系統間に見出したRad50遺伝子のp.200Gly>Val変異のSTZ感受性への影響を検証するため、以下の実験を行った。 1. Mpg遺伝子のSTZ感受性効果の検証前年度に作製したA/J-Mpg・KI（p.132Ser>Ala）マウスを系統化し、STZ多量単回投与後の血糖値の変化を調査した。A/J-Mpg・KIマウスの繁殖不良が続いてたことにより十分な個体数を用いた解析ができていないが、現時点でA/J-Mpg・KIマウスのSTZ投与後の血糖値の変化はA/J系統と同程度であり、糖尿病発症を抑制できていない。また、本年度はA/J-Mpgノックアウト（KO）マウスについてもSTZ感受性を調査した。その結果、A/J-Mpg・KOマウスではSTZ多量単回投与後の血糖値の上昇が有意に抑制されることが確認できた。 2. Rad50遺伝子のSTZ感受性効果の検証前年度に作製したC3H.NSY-Chr11サブコンジェニック-Rad50・KI（p.200Val>Gly）マウスのSTZ少量頻回投与後の血糖値の変化を調査した。その結果、Rad50・KIマウスの血糖値の上昇はC3H.NSY-Chr11サブコンジェニック系統と比較して抑制される傾向にあり、糖尿病発症率も低下することが確認できたが、その効果は弱いものであった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason Rad50遺伝子のp.200Gly>Val変異のSTZ感受性効果の検証については、NSY系統のRad50遺伝子変異（p.200Val）をC3H系統型（p.200Gly）に置換したC3H.NSY-Chr11サブコンジェニック-Rad50・KIマウスを樹立・解析し、当該変異がSTZ感受性効果を持つことを示唆するデータを得ることができた。一方、Mpg遺伝子のp.132Ala>Ser変異のSTZ感受性効果の検証については、A/J系統のMpg遺伝子変異（p.132Ser）をSM/J系統型（p.132Ala）に置換したA/J-Mpg・KIマウスを樹立し、表現型解析を開始したが、A/J-Mpg・KIマウスの繁殖不良が続いたことにより十分な個体数を用いたSTZ感受性の解析ができておらず、Mpg遺伝子のp.132Ala>Ser変異の影響を十分に検討できていない。そのため、本研究課題は1年間研究期間を延長することとした。
Strategy for Future Research Activity	1. Mpg遺伝子のSTZ感受性効果の検証 A/J-Mpg・KIマウスの個体数を十分に確保してSTZ投与後の表現型解析を行い、p.132Ala>Ser変異のSTZ感受性への影響を検討する。そのうえで、p.132Ala>Ser変異がSTZ感受性に影響しないことが判明した場合は、A/JとSM/J系統間に認められるMpg遺伝子の別の変異について再検討し、有力な変異が存在する場合はゲノム編集技術によりその変異のノックイン置換マウスを作製し解析する。 2. Rad50遺伝子のSTZ 感受性効果の検証 C3H.NSY-Chr11サブコンジェニック-Rad50・KIマウスの解析により、Rad50遺伝子のp.200Gly>Val変異がSTZ感受性効果を持つことを示唆するデータが得られているが、その効果は弱いため、Rad50・KIマウスのSTZ投与後の血糖値測定を継続するとともに、血中インスリン値の測定や膵島の病理学的解析を行い、p.200Gly>Val変異の影響を十分に検討する。
Causes of Carryover	次年度使用額が生じた理由:ゲノム編集マウスの繁殖不良が続いたことに加え、研究代表者が病気により長期入院したことにより当初予定していた解析に着手できなかったために次年度使用額が生じた。次年度使用額の使用計画:ゲノム編集マウスの飼育経費やSTZ感受性解析に必要な試薬類・消耗品類の購入に充てる。