2018 Fiscal Year Annual Research Report
Screening for radiosensitizing molecular target drug
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17K15026
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
小野寺 貴恵 (山内貴恵) 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 特任研究員 (20535736)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | APOBEC3G / 阻害剤 / 分子標的治療 / 抗がん剤 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
がん治療において、物理的精度の向上や低侵襲性という面からも放射線治療の増加が見込まれる一方、放射線治療の増感剤としては臨床に定着したものはほとんどない。これまでに当研究室で行われた網羅的スクリーニングによりノックダウンにより放射線増感を示す増感標的遺伝子の候補として見出されたAPOBEC3G（A3G）について、本研究ではA3Gノックダウン下における放射線増感の検証と増感機序の解析を行うとともに、A3G阻害剤スクリーニング系の構築を行った。
siRNAを用いてA3Gノックダウンを行うことで、特定のがん細胞株においてγ線感受性の亢進が認められ、A3Gの機能阻害が確かに放射線増感作用を示すことを明らかにした。また、A3Gノックダウン下でγ線照射を行った際の細胞周期解析から、A3GがDNA二本鎖切断修復に関与していることが示唆された。
スクリーニング系の構築においては、まず、A3G全長と、核酸結合ドメインを含まずに活性ドメインのみを含むC末端側ドメイン（A3G-CD2）の二種類を調製した。実験当初、A3G、A3G-CD2はともに大腸菌内で封入体として発現したが、コンストラクトや発現条件を検討して最適化することで、可溶性のタンパク質として大量に発現させる発現条件を決定することが出来た。また、当初計画ではポリアクリルアミド電気泳動を用いて基質DNAの移動度を比較することにより酵素活性を測定する予定であったが、文献調査等を行った結果、両末端を蛍光標識したDNAを基質とし、基質のFLETの有無を測定することによる活性測定法に変更した。FLETを用いた検出法では電気泳動よりも短時間で多数のサンプルの酵素活性を定量的に測定することが可能であり、より効率的なスクリーニングが可能であると期待できる。
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