コンデンシンⅠの活性化におけるCDK１の役割

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K15070
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 田根 将志 国立研究開発法人理化学研究所, 平野染色体ダイナミクス研究室, 特別研究員 (40770516)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: コンデンシン / 染色体形成 / CDK1 / リン酸化制御

Outline of Annual Research Achievements

コンデンシンⅠは、染色体の構築において中心的役割を果たすタンパク質複合体である。我々の研究室ではこれまでに、6種類の精製タンパク質（コアヒストン、ヌクレオプラスミン、Nap1、FACT、トポイソメラーゼⅡ、およびコンデンシンI）を用いた試験管内染色体再構成系において、コンデンシンI の CDK1 によるリン酸化が染色体再構成に必要かつ十分な唯一のタンパク質修飾であることが示されている。しかしさらにこのリン酸化制御の詳細を理解する上で、コンデンシンⅠのどのサブユニットのどの部位が CDK1 によってリン酸化されるのか、そして個々のリン酸化反応がコンデンシンⅠの機能をどのように制御しているのか、という問いに答えることは重要である。これまでに、昆虫細胞を用いてコンデンシンⅠサブユニット内にある計10ヶ所の CDK1 リン酸化候補部位をアラニン変異に置換した組換えホロ複合体（10A 変異体）を発現・精製を行った。そして、内在性コンデンシンを除去したカエル卵抽出液へこの10A 変異型複合体を添加し、それが引き起こす染色体形態の異常について観察を行った。その結果、10A変異型複合体を用いて形成された染色体は、野生型と比べて若干の形態異常しかみとめられなかった。しかしながら、精製した複合体には若干の技術的懸念が生じていることが判明したため、その解消を目指すとともに他の候補部位にも対象を広げ詳細な解析を進めていく。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初計画していた通り、新たに４ヶ所のCDK1 リン酸化候補部位に対するリン酸化抗体を作製した。現在までに、そのいくつかで有望な結果を得ている。またこれまでに、計10ヶ所の CDK1 リン酸化候補部位を含め複数の変異複合体の機能解析を進めることができた。また現在までに、精製した複合体に生じていた技術的懸念についても概ね解消できつつある。

Strategy for Future Research Activity

(1)引き続き他の候補部位にもアラニン変異を加え、内在性コンデンシンを除去したカエル卵抽出液中で機能解析を進める。
(2) 染色体形成に対するコンデンシンI とCDK1 の関係をより直接的な手法により調べるために、精製タンパク質を用いた試験管内再構成系への組換えコンデンシンⅠ複合体の導入を試みる。

Causes of Carryover

複数の組換えコンデンシンⅠ変異複合体の作製・解析を予定しているため、主には組換えタンパク質の発現・精製や機能解析にかかる試薬等の購入に使用する。