2017 Fiscal Year Research-status Report
Parkinを活性化させるリン酸化Ubiquitinの構造揺らぎ機能相関研究
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17K15078
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| Research Institution | Ritsumeikan University |
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Principal Investigator |
北沢 創一郎 立命館大学, 薬学部, 助教 (50779030)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | リン酸化ユビキチン / 圧力 / 構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
パーキンソン病関連タンパク質であるPINK1によりSer65がリン酸化されたリン酸化ユビキチンは、水溶液中で二つの天然状態(MajorとMinor)を持ち生理的条件下でおよそ7:3で揺らいでいる。リン酸化ユビキチンはパーキンソン行関連タンパク質であるParkinを活性化させる。また、リン酸化ユビキチンを模倣したリン酸化ユビキチン模倣変異体(S65E,S65D)はPINK1をバイパスしParkinを活性化させることが知られている。本研究ではMajorとMinorの構造の揺らぎがどのように機能に影響を与えているかを解明することを目的としている。
コンホメーション変化に敏感な高圧力NMR法を用いてリン酸化ユビキチン及びリン酸化ユビキチン模倣変異体の構造揺らぎ研究を行った。リン酸化ユビキチンのMajor状態は、非リン酸化ユビキチンと類似した化学シフトの圧力応答を示したことから、Major状態は非リン酸化ユビキチンの構造揺らぎを保存していることが推察された。それに対して、Minor状態では化学シフトの圧力応答が非リン酸化ユビキチンと異なる結果を得た。これは天然状態が非リン酸化ユビキチンと明らかに異なった構造であるためであると考えられる。
次に、側鎖を含むNMR信号の帰属を行った。帰属は1H,15N,13C標識されたリン酸化ユビキチンで行った。化学シフト情報から二面角予想プログラムTALOS+による二面角を計算し、それらとNOEによる原子間の距離情報から立体構造を計算した。Major状態とMinor状態ともに十分に収束した構造を得られた。現在、より精密化された構造のためにF4,K33,Q40,L71,L73などの残基にシステインを導入し、常磁性緩和促進法による距離情報を集め構造計算を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
立体構造研究及び構造揺らぎ研究はおおよそ計画通り順調に進んでいる。リン酸化ユビキチンの立体構造についてはNOEによる距離情報と二面角情報から構造の計算に成功した。追加で常磁性緩和促進法による距離情報を集め構造計算に応用する予定である。
構造揺らぎ研究についてはリン酸化ユビキチンの高圧力NMRの結果を現在解析中であり、その結果を受けて状態転移速度に着目した測定を始める予定である。
また、リン酸化模倣変異体についても高圧力NMR法による解析を行っており、圧力・温度などによりMinor状態が増加しないことを確認している。
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| Strategy for Future Research Activity |
立体構造や構造揺らぎ研究はおおよそ進んだことから、今年からその機能活性に注目し研究を進める予定である。具体的にはウエスタンブロッティング法やEnzyme-Linked ImmunoSorbent Assay(ELISA)法などを行う。
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| Causes of Carryover |
当該助成金が生じた理由として同位体標識されたリン酸化ユビキチンが非常に収率よく取れたことが理由の一つに挙げられる。NMRによる蛋白質研究では同位体により標識する必要がある。それが効率よく進んだことから費用を抑えることになった。持ち越し分はリン酸化ユビキチンのより効率的な精製のために紫外可視吸光装置などの購入もしくは追加の同位体標識試薬と抗体などのために使用すると計画している。
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