新規の活性化機序のリン脂質スクランブラーゼの同定と機能解析

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K15079
• Research Institution: Osaka University of Pharmaceutical Sciences
• Principal Investigator: 藤井 俊裕 大阪薬科大学, 薬学部, 助教 (30580104)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: リン脂質スクランブラーゼ / ホスファチジルセリン / P2X7 / P2rX7 / BzATP

Outline of Annual Research Achievements

LPSで刺激を受けたマクロファージは、ATPまたは3'-O-(4-Benzoylbenzoyl)adenosine 5'-triphosphoric acid (BzATP) により、ホスファチジルセリン(PS)を細胞膜外葉へ暴露させるが、その分子機序も生理的意義も十分に解析されていない。申請者は、BzATP による PS 暴露が、現在までに同定されているリン脂質スクランブラーゼとは異な活性化機序で働く分子が関わっている実験結果を得た。 そこで本研究は,この未知のリン脂質スクランブラーゼの同定と活性化機序を含む機能解析と生理的意味を明らかにすることを目的としている。

平成29年度は、この未知のリン脂質スクランブラーゼの同定ために、スクリーニングに適した細胞の樹立と実験条件の確立に時間を費やした。浮遊細胞のWR19L細胞株の中で、BzATPの感受性が高い細胞をサブクローニング試みた。この時、BzATPは長い時間、細胞を刺激すると細胞死を誘導することが知られている。そこで、BzATPの濃度、刺激時間や温度を条件検討し、細胞表面にPSを暴露するが、細胞は死なない条件を探し、この条件でサブクローニングを行った。さらにBzATPは陽イオンチャネルのP2X7を活性化させてカルシウムを細胞質内へ流入させることが知られている。そこでカルシウム依存性のリン脂質スクランブラーゼの影響を無視するために、CRISPR/Cas9システムを用いて、BzATP高感度WR19L細胞のTMEM16F遺伝子を欠損させた。

次に、この作成したWR19L細胞にCRISPR/Cas9 GeCKOライブラリで様々な遺伝子を欠損させた細胞群を作成した。この細胞からBzATPを介するPS暴露が起きない細胞をソーティングを行っている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

スクリーニングに向いている細胞の選択、BzATPに感受性の高い細胞のサブクローニング、そして、死なない条件で細胞表面にPSを暴露する実験方法の確立、各ステップで当初計画していたペースより時間がかかってしまった。
また現在行っているスクリーニングで、BzATPに応答してかつPSを暴露しない細胞のクローニングがうまくいっていない。

Strategy for Future Research Activity

現在のスクリーニング方法で、細胞を検出するための試薬を変更するなどを試す予定である。
それでも目的の細胞をクローニングすることが困難な場合は、スクリーニング方法を根本的にかえる。
P2X7を強制発現させた細胞で、BzATPによるPSが暴露しない細胞株を見つけ出す。その後、BzATPに応答してPSを露出する細胞のcDNAライブラリー作成し、この細胞に導入する。導入した細胞のなかでBzATPによるPS暴露が起きた細胞のみをFACSでソーティングする。ソーティングした細胞のゲノムDNAから組込まれたcDNAライブラリに含まれる遺伝子を同定する予定である。