2019 Fiscal Year Research-status Report
新規の活性化機序のリン脂質スクランブラーゼの同定と機能解析
| Project/Area Number |
17K15079
|
|---|
| Research Institution | Osaka University of Pharmaceutical Sciences |
|---|
Principal Investigator |
藤井 俊裕 大阪薬科大学, 薬学部, 助教 (30580104)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | リン脂質スクランブラーゼ / ホスファチジルセリン / P2X7 / P2Xr7 / BzATP |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
LPSで刺激を受けたマクロファージは、ATPまたは3'-O-(4-Benzoylbenzoyl)adenosine 5'-triphosphoric acid (BzATP) により、ホスファチジルセリン(PS)を細胞膜外葉へ暴露させるが、その分子機序も生理的意義も十分に解析されていない。申請者は、BzATP による PS 暴露が、現在までに同定されているリン脂質スクランブラーゼとは異なる活性化機序で働く分子が関わっている実験結果を得た。 そこで本研究は、この未知のリン脂質スクランブラーゼの同定と活性化機序を含む機能解析と生理的意味を明らかにすることを目的としている。
平成29年度は、この未知のリン脂質スクランブラーゼを同定するために、スクリーニングに適した細胞の樹立をした。BzATPに感度が高いWR19L細胞から他のスクランブラーゼの可能性を排除するためにカルシウム依存性リン脂質スクランブラーゼであるTMEM16Fの遺伝子を欠損させた細胞を樹立した。
平成30年度は、このWR19L細胞からCRISPR/Cas9 GeCKOライブラリーで様々な遺伝子を欠損させた細胞群からBzATPでPS暴露が起きない細胞をFACSでソーティングするための条件を決定した。BzATPを15℃以下で反応させると、細胞は速やかにPSを暴露し、またBzATPを除去すると細胞が死なない状態でPSが細胞内膜へ戻る条件を見出した。この条件でPS暴露が起きない細胞をFACSでソーティングを行った。
令和元年は、BzATPはATP依存性イオンチャネルであるP2X7のアゴニストとして知られており、P2X7が活性化すると細胞内へカルシウムイオンが流入することが明らかになっている。そこで細胞内のカルシウム濃度を検知する試薬を用いて、BzATPで活性化した細胞の中からPSの細胞外の暴露しない細胞をソーティングを行った。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
CRISPR/Cas9 GeCKOライブラリーで様々な遺伝子を欠損させたWR19L細胞群からBzATPでカルシウムの細胞内流入かつPS暴露が起きない細胞をFACSでソーティングしたが、ソーテイングが期待通りの結果が出ないため望む細胞群の濃縮ができない。原因としてBzATPの感度を評価するカルシウムを感知する試薬の感度が低いことが考えられる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
BzATPはATP依存性イオンチャネルであるP2X7のアゴニストとして知られており、P2X7が活性化すると細胞内へカルシウムイオンが流入することが明らかになっている。そこでBzATPが細胞に作用していることを保証するために、細胞内のカルシウム濃度の上昇が顕著な細胞株をソーティングなどによって樹立する。または、P2X7遺伝子とP2X7のシャペロンタンパク質として知られているEros遺伝子を過剰発現させることで、BzATPへの応答が鋭敏な細胞を樹立する。これら樹立した細胞を用いて、CRISPR/Cas9 GeCKOライブラリーで様々な遺伝子を欠損させた細胞群からBzATPに反応して、ホスファチジルセリンを細胞膜外葉に暴露しない細胞をソーティング、次世代シークエンスを行う。
また、上記でも実験が進まない場合は、P2X7遺伝子自身がリン脂質スクランブラーぜ活性を持つのか検討する。
|
Research Products
(1 results)
