2017 Fiscal Year Research-status Report
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17K15082
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
村山 祐子 国立研究開発法人理化学研究所, ライフサイエンス技術基盤研究センター, 研究員 (50708592)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | RNAポリメラーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
RNAポリメラーゼ(RNAP)は細胞内における遺伝情報の転写を行う、分子量約400 kDaのタンパク質複合体である。RNAPよる転写は開始、伸長、終結の３つの段階から成っている。これらの各過程において、様々な転写因子や新生RNAがRNAPに結合し、その活性を調節することが知られている。RNAPは、これらの制御因子の結合によってダイナミックに構造を変化させ、活性を切り替えていることが、これまでの構造生物学的研究によって明らかになってきた。しかしながら、転写の終結段階におけるRNAPの構造は未だに解明されておらす、転写終結の具体的なメカニズムは分かっていない。本研究では、転写終結因子RhoおよびNusGを結合したRNAP複合体の構造を解明することにより、転写終結の構造基盤を明らかにすることを目指す。
転写終結因子Rhoは分子量約300 kDaの六量体型RNAヘリケースであり、転写中の新生RNA上にある転写終結シグナル配列に結合する。Rhoはヘリケース活性によって新生RNA上をRNAPに向かって進み、RhoがRNAPに追いつくことによって転写終結が引き起こされると考えられている。NusGは転写伸長複合体に安定に結合する転写因子であるが、そのC端側ドメインがRhoと結合することによって、転写複合体へのRhoのリクルートを助け、Rho依存転写終結を促進することが知られている。
本研究ではこれまでに、大腸菌由来のRNAP、Rho、NusGを構造解析用に大量に調製し、その活性を確認した。RNAPとRhoそれぞれについてネガティブ染色電子顕微鏡により予備的な構造解析を行い、良質なサンプルが得られていることを確認した。また、Rhoを結合する前段階であるRNAPの伸長複合体とNusGのホモログであるRfaHとの複合体について、低温電子顕微鏡による構造解析を行い、予備的な構造情報を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
大腸菌由来転写終結因子Rhoのクローニングおよび精製を行った。精製方法の検討の結果、安定なサンプルを得ることに成功し、ネガティブ染色電子顕微鏡により、Rhoが均一な六量体を形成していることを確認した。また、このサンプルを用いて転写終結実験を行い、調製したRhoが転写終結活性を有することを確認した。
並行して、NusGのホモログである転写伸長因子RfaHを結合した転写伸長複合体を調製し、低温電子顕微鏡による予備的な構造解析を行った。現在までに分解能５Å程度の予備的な構造を得ており、この構造から得られた構造情報や電子顕微鏡構造解析用サンプルの調製方法は、今後Rhoとの複合体調製に活用できると考えている。
高度好熱菌由来のRhoおよびNusGについてもクローニングおよび精製を行った。NusGについては調製に成功したが、Rhoは非常に凝集を起こしやすく、現時点では構造解析に十分な量のサンプルは得られていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、RfaHを結合した伸長複合体の構造解析を進めるとともに、RNAPに核酸およびRhoを結合した転写終結複合体の調製を行い、低温電子顕微鏡構造解析による同複合体の構造解明を目指す。転写終結段階において、RNAPはDNAおよびRNAと解離する際に大きな構造変化を起こすことが予想され、そのため安定な複合体を得ることは比較的困難であると考えられる。そこで、RhaHを結合した伸長複合体の構造情報も参考にしながら、様々なRNAおよびDNAの配列を用いて複合体調製を行い、より安定な複合体を得ることを目指す。必要に応じて、因子間のクロスリンクや、変異体タンパク質の利用によって、複合体の安定化を試みる。また、好熱菌由来のRhoの調製方法を検討し、大腸菌由来の複合体と並行して構造解析を行う。、Rho依存転写終結複合体の構造解析が成功しなかった場合には、転写終結の促進に関わる転写因子NusAを含む複合体など、別の転写因子を含む複合体の構造解析を試みる。
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| Causes of Carryover |
合成RNAの購入等の費用が多く必要となった場合を想定して一年目の費用を申請したが、タンパク質試料の精製方法の検討に時間を要したため、RNAの購入等は次年度以降に回すこととなった。
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