2018 Fiscal Year Research-status Report
ノンコーディングRNAの新規機能分類「Architectural RNA」の確立
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17K15084
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
中條 岳志 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 特任助教 (50788578)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | architectural RNA / Sam68 nuclear body / FABS |
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| Outline of Annual Research Achievements |
癌関連の核内顆粒として知られるSam68 nuclear body (SNB)は、RNA分解酵素感受性を示すことなどから、顆粒構築に必要なRNAが存在すると考えられる。私たちが難溶性RNAを同定したHeLa細胞においてもSNBは存在するが、難溶性RNAの中には、SNBを構成するRNAは無かった(Chujo et al. EMBO J. 2017)。また、核内顆粒の骨格として働く既知の長鎖ncRNAの中には、難溶性を示さない核内顆粒構築ncRNAも知られている。従って、難溶性を示さないRNAがSNBの構築に関わると考えられ、このように難溶性を示さない核内顆粒構築RNAを探索する方法を世界で初めて開発することを目的とした。一般に核内顆粒を構築するRNAは、必ずその核内顆粒の内部に存在することから、私は、SNBを構築するRNAの探索方法として、Fluorescence activated cell sorting (FACS)法の活用を試みることを考えた。すなわち、FACSによってSNBを単離し、内部のRNAを同定すれば、SNBを構築するRNAの有力候補を得られるはずであると考え、この方法をFluorescence activated body sorting (FABS)法と名付けた。研究材料としては、蛍光タンパク質Venusを融合したSam68 (Venus-Sam68)を安定的に発現するHeLa細胞を使用し、(1)セルソータにより直径200 nmの微細粒子の分離可能性の確認、(2)細胞の前処理方法の開発、(3)FACSによるSNBの単離を実施した。単離した顆粒においてSNBのマーカータンパク質である内在Sam68と内在HNRNPLは濃縮した一方で、核小体マーカータンパク質Nucleolinはほとんど含まれていなかったことから、FABS法によりSNBの濃縮が行えたことを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
FABS法により、Sam68 nuclear bodyを濃縮することができた。早稲田大学浜田研との共同研究で、難溶性RNAの結合タンパク質に関する共同研究も進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
FABS法により濃縮されたSam68 nuclear bodyに含まれるRNAの次世代シーケンス解析を行うことで、Sam68 nuclear bodyを構築するarchitectural RNAを同定したい。また、もしFABS法において、Venus-Sam68を指標にした1段階の濃縮では濃縮が不十分な場合は、内在のボディマーカータンパク質の染色を行うといった工夫を行うことで、２段階のFABSを行うといった改善法も考えている。
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[Presentation] Multiple NEAT1 modular RNA domains cooperatively construct phase-separated, distinct, highly ordered paraspeckle nuclear bodies2018
Author(s)
Tomohiro Yamazaki, Sylvie Souquere, Hiro Takakuwa, Hyura Yoshino, Takeshi Chujo, Archa Fox, Charles Bond, Shinichi Nakagawa, Gerard Pierron, and Tetsuro Hirose
Organizer
JAJ RNA 2018
Int'l Joint Research
