2018 Fiscal Year Research-status Report
細菌ロンボイドプロテアーゼGlpGによるべん毛Ⅲ型分泌装置の機能制御機構の解析
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17K15091
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
檜作 洋平 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 助教 (70568930)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 大腸菌 / Rhomboid / 膜内切断プロテアーゼ / 基質認識 / べん毛 / III型分泌装置 / 膜タンパク質 / アシル化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は大腸菌RhomboidプロテアーゼホモログGlpGの生理的切断基質候補として新たに見出されたべん毛III型分泌装置構成因子である膜タンパク質FliOについて、GlpGによるFliOの切断がべん毛III型分泌装置の機能発現・維持にどう関与するのかという生理学的意義を明らかにするとともに、Rhomboidプロテアーゼの普遍的性質の解明を目指すものである。また、昨年度の研究成果を受け、新奇のFliOの修飾の実態及びその生理的意義の解明も新たな研究目的とした。本年度は主にFliOの切断に焦点を当てて研究を行い、以下の研究結果を得た。(1) FliO解析用モデル基質の構築：FliOは低分子タンパク質であり切断解析が困難であることから、FliOのC末端にMBP及び検出用タグを付加した融合タンパク質を構築し、解析系を最適化した。(2) GlpGによるFliO基質認識機構の解析：Rhomboidファミリープロテアーゼの基質認識条件とされる、切断部位周辺の特定のアミノ酸配列（基質認識モチーフ）及び基質膜貫通領域のヘリックス不安定性の二点に関して上記FliOモデル基質を用いて変異体解析を行い、これら二点の条件がGlpGによる効率的な切断に重要であることを示した。(3) 大腸菌染色体改変によるnative FliO及びGlpGの解析系の確立：染色体改変により染色体上fliOあるいはglpGのC末端に検出用タグを付加した改変株を構築し、生理的発現条件下でのFliOあるいはGlpGの検出・解析系を確立した。このfliO改変株でGlpGを過剰発現させることで染色体由来のFliOが切断を受けることを確認した。以上、(1)～(3)の成果は、本研究の目的であるGlpGによるFliOの詳細な切断機構への理解を与えると共に、FliO切断の生理的意義の解明の分子的基盤を与えるものである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は申請書の研究実施計画の項目【1】～【5】から構成される。また、昨年度の研究成果によりFliOが予想外に複雑な多段階プロセシング（修飾及び切断）を受け得ることが明らかとなったため、当初の研究計画を修正し、N末端アシル化修飾の実態及びその生理的意義を明らかにすることも新たな研究目的としている。本年度は項目【1】：「in vivo におけるGlpG によるFliO 切断の詳細解析とその生理的意義の検証」を重点的に進め、【研究実績の概要】に示した(1)～(3)の成果を得た。(1)、(2)の成果はGlpGによるFliOの切断機構解明に向けて最適な切断解析系を構築した上で、変異解析により基質切断機構を詳細に検証、解析したものである。また、(3)の成果はGlpGによるFliO切断の生理的意義の解明に向けて欠くことのできない染色体由来FliO及びGlpGの検出・解析系を確立したものであり、今後の解析をスムーズに進めることが可能になる。これらの成果から、項目【1】に関しては学術雑誌への論文投稿も見据えて研究を取りまとめていく段階にあると言える。また、(1)のFliOのモデル基質の構築については、FliO基質の発現・精製系の構築を容易にするため、項目【2】：「in vitro 再構成系でのGlpG によるFliO 切断の反応速度論的解析」の進捗にもつながっている。また、(3)の染色体改変による染色体由来FliO及びGlpGの検出系の確立については、項目【3】：「様々な架橋法を用いたGlpG の分子間・分子内相互作用解析」におけるin vivo光架橋解析系の構築にも必要な改変株であるため、その進捗にもつながっている。さらに、(1)、(3)の解析系は今後のFliO修飾の解析にも必要となる。以上の観点から、ここまでの研究計画はおおむね順調に進展していると判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は項目【1】：「in vivo におけるGlpG によるFliO 切断の詳細解析とその生理的意義の検証」の内容での学術雑誌への論文投稿を見据え、研究成果のとりまとめのために以下の研究を行う。1) 染色体由来GlpGにより染色体FliOが切断（分解）を受ける生理的発現条件を探索する。1)-i：培地組成、培養条件による探索。1)-ii：LacZレポーターを用いた発現条件及び突然変異体スクリーニング。2) pulse chase解析により染色体FliOの切断・分解の動態を解析する。3) 詳細な基質認識機構のため、基質認識モチーフ及びヘリックス不安定化領域の変異体解析をさらに進める。また、項目【3】：「様々な架橋法を用いたGlpG の分子間・分子内相互作用解析」に向け、FliO及びGlpGのpBPA導入系を構築し、in vivo光架橋解析を行う。また、項目【2】：「in vitro 再構成系でのGlpG によるFliO 切断の反応速度論的解析」に向け、FliOモデル基質及びGlpGの大量発現・精製系を確立し、in vitroでの切断アッセイを試みる。
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| Causes of Carryover |
今年度の使用状況：（物品費）設備備品等は申請者がこれまで行ってきた大腸菌膜内切断プロテアーゼ関連の解析等を発展させたものであり、研究室の保有機器及び研究所の共同利用機器を使用することで研究遂行が可能であった。本年度は消耗品等については関連因子の抗体作製や修飾試薬、架橋試薬等の購入を見送ったため、使用額が減少した。（旅費）国外学会の参加を見送ったこと、共同研究の打ち合わせが必要なかったこと等から使用額が減少した。（人件費・謝金等）論文作成時の英文校閲費用等がまだ必要とならなかったことによって使用額が減少した。（その他）計上していた論文投稿料が必要とならなかったことによって使用額が減少した。
次年度の使用計画：（物品費）研究の進捗状況により、光架橋法やin vitro再構成系の構築に必要となる脂質や蛍光試薬、架橋試薬等の購入費、各種関連因子の抗体作製費等で使用する予定である。（旅費）次年度は積極的に学会に参加し、発表する予定である。（人件費・謝金等）次年度は研究成果をとりまとめ論文作成に取り掛かる予定である。その際には英文校閲費等を計上する。（その他）論文投稿料を計上する予定である。
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Research Products
(6 results)
