2017 Fiscal Year Research-status Report
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17K15094
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
丹羽 祐貴 慶應義塾大学, 理工学部(矢上), 助教 (20756077)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | C-mannosylation / DPY19 / CRISPR/Cas9 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質の糖鎖修飾の一種であるC型糖修飾(C-mannosylation)は、その機能の多くが未解明であったが、近年の研究によりタンパク質の分泌や細胞内輸送、酵素活性など様々なタンパク質機能に影響を及ぼすことが分かってきた。また我々の先行研究ではDPY19ファミリータンパク質の1つDPY19L3がC型糖修飾酵素であることを世界に先駆けて報告し、さらにはDPY19ファミリー以外のC型糖修飾酵素の存在を示唆した。そこで本研究では、DPY19ファミリー以外のC型糖修飾酵素が存在するか否かを詳細に検証し、新規C型糖修飾酵素を同定することを目的とした。
まず、新規C型糖修飾酵素をスクリーニングするための系を構築した。既にC型糖修飾がその分泌に重要であることが分かっているR-spondin1 (Rspo1)と、分泌型ルシフェラーゼ(Gluc)の融合タンパク質(Rspo1-Gluc)を過剰発現する細胞を樹立し、Rspo1-Glucの分泌がC型糖修飾により制御されるか否かを評価した。その結果、C型糖修飾の阻害によりRspo1-Glucの分泌は抑制されたことから、1次スクリーニング系を確立した。また、2次スクリーニング系であるC型糖修飾の有無をSDS-PAGEにより分離する手法は既に確立済みであり、これにより新規C型糖修飾酵素のスクリーニング系が構築できた。
一方で我々が用いた手法とは異なるCRISPR/Cas9を用いた遺伝子ノックアウトにより、マウスDPY19L1及びDPY19L3がC型糖修飾酵素活性を有することが報告されたことから、新規C型糖修飾酵素が存在するか否かを詳細に検証する必要性が生じた。そこで我々もCRISPR/Cas9を用いてDPY19ファミリーをノックアウトし、検証を行うこととした。現在これらのノックアウト細胞を樹立中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の研究計画では、新規C型糖修飾酵素の探索のための1次及び2次スクリーニング系が構築でき次第、siRNAライブラリを用いたスクリーニングを開始する予定であった。しかし、系を構築している最中に他の研究グループより、我々の用いた手法とは別の手法であるCRISPR/Cas9を用いた方法で、マウスDPY19L1とDPY19L3がC型糖修飾酵素活性を有することが報告された。この報告から、我々が探索を試みているC型糖修飾酵素は新規ではなく、DPY19L1あるいは他のDPY19ファミリーである可能性が浮上した。これは本研究計画の根幹に関わる部分であり、我々も検証する必要があると考えた。そこで先行研究と同様の手法であるCRISPR/Cas9を用いた遺伝子ノックアウトにより再検証を行うこととした。現在、DPY19ファミリーをそれぞれノックアウトした細胞株の樹立を行っている。
当初計画のRspo1に対する新規C型糖修飾酵素は上記のように存在しない可能性が浮上した一方で、別の実験結果から他の複数のC型糖修飾タンパク質でやはりDPY19ファミリー以外の新規C型糖修飾酵素が作用している可能性が強く示唆されている。以上のことから、当初の目的通り新規C型糖修飾酵素は存在しその探索は可能であると考えられるため、おおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在までに新規C型糖修飾酵素の探索のためのスクリーニング系は構築できているものの、探索を行おうと考えている酵素が新規ではない可能性が生じてきたため、まずはその検証を行う必要があると考えている。現在、先行研究と同様の手法であるCRISPR/Cas9によるDPY19ファミリーのノックアウト細胞を樹立しているため、その樹立が出来次第、その培養上清よりRspo1を精製し、質量分析によりC型糖修飾の有無を解析することで、Rspo1に対する新規C型糖修飾酵素が存在するか否かを検証する。
一方でRspo1に対する新規C型糖修飾酵素が存在しない可能性を鑑み、DPY19ファミリー以外の新規C型糖修飾酵素が作用していると示唆されている他のC型糖修飾タンパク質でも解析を進める。まず、これらタンパク質でも上記と同様にCRISPR/Cas9を用いた方法でDPY19の可能性について検証する。この検証と同時に、これらC型糖修飾タンパク質のC型糖修飾の機能を検証し、スクリーニングに用いることのできる表現型を探索する。これらの検証を行うことで、新規C型糖修飾酵素が作用しており、最もスクリーニングに用いやすいC型糖修飾の機能を有するタンパク質を選定する。最後に、選定したタンパク質をスクリーニングへと応用する系を考案し構築後、その系が確かにC型糖修飾の有無を判別可能か否かを検証する。
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Research Products
(12 results)
