2018 Fiscal Year Research-status Report
モノADPリボシル化毒素に不可欠な2種類の特異性を理解する
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17K15095
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
吉田 徹 京都産業大学, 総合生命科学部, 研究助教 (30724546)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ADPリボシル化 / 基質特異性 / 翻訳後修飾 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ADPリボシル化酵素ScARPは、NAD+ を利用してguanineにADPリボースを付加する。前年度に決定した酵素-基質複合体（ScARP-GDP-NAD+）構造において基質認識に関わっているアミノ酸残基の重要性を、生化学実験により検証した。まず、基質（GDP、NAD+）と生成物（ADPリボース、ADPリボシル化GDP、ニコチンアミド）、合計５つの化合物をHPLCで分離するための条件を決定した。その後、基質認識に関わるアミノ酸の変異体ScARPによる反応産物をHPLCにより確認した。その結果、複合体構造において基質を認識しているアミノ酸の重要性を支持する結果を得ることが出来た。また、基質認識に重要なアミノ酸Q165をE165に置換すると、guanineに対する活性は失われるにもかかわらず、ScARP自身がADPリボシル化されることが明らかになった。これは、GlnをGlnに変えたことで基質特異性が変化したことを示唆しており、本研究課題の本質であるADPリボシル化酵素の基質特異性を理解する上で重要である。今後、Q165E変異体においてどのアミノ酸がADPリボシル化されているのか、確認していく。
Pierisinは、ScARPと異なり二本鎖DNAにADPリボースを付加する。特異的に結合する二本鎖DNA配列の探索を試みたが、配列の決定には至っていない。精製したPierisinが正しくフォールディングされていない可能性も含め、実験条件の再検討を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ScARPの基質認識機構を構造・生化学実験により明らかにすることが出来た。また、ScARP変異体により基質認識が変化する可能性が見出されたため、基質認識機構のさらなる理解につなげることが出来る。
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| Strategy for Future Research Activity |
Q165E変異体ScARPにおいてADPリボシル化されているアミノ酸を、質量分析により明らかにする。また、二本鎖DNAのguaninieをADPリボシル化する酵素Pierisinについて、特異的に結合するDNA配列の解明を目指す。また、現在精製しているPierisinが正しくフォールディング出来ていない可能性もあるため、発現系の再構築を行う。
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| Causes of Carryover |
ScARPについての国際学会での発表を見込んで、本年度の支出を抑えた。
次年度予算は国際学会での発表、パソコンの購入などに充てる。
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