2017 Fiscal Year Research-status Report
ゲノム編集タンパク質Cas9の動的構造解析に基づくDNA配列認識機構の解明
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17K15100
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
小森 智貴 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 特任助教 (50542289)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | １分子計測 / 構造ゆらぎ / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成２９年度に於いてはゲノム編集タンパク質Cas9のタンパク質内構造ゆらぎに着目して、ターゲットDNA認識、切断機構を解明する為に、ヌクレアーゼドメイン(HNHドメイン)のDNA認識、切断に伴う構造ゆらぎの計測を１分子FRET法を用いて計測、解析を行なった。これまでの研究でCas9の構造は核酸（single guide RNAおよび切断されるDNA)が全く結合していない状態に於いては形が一定に定まらない非常に柔軟な構造を取っており、single guide RNAがCas9分子に結合する事により、その構造状態が安定化される事が１分子FRET方法により明らかになった。また引き続いてターゲットDNAおよびマグネシウムがCas9に結合する事によりCas9の構造が再び不安定化されて、HNHドメインが再び大きくゆらぎ始める事が明らかとなった。また、このHNHドメインの遷移状態は３状態（中間状態、プレ切断状態、切断状態）取っており、マグネシウム非存在下に於いては中間状態とプレ切断状態しか取る事が出来ないが、マグネシウムのCas9結合によりHNHドメインの構造状態がよりダイナミックになり、中間状態とプレ切断位置に加えて、切断状態も取る事が出来るようになる事が判明した。これまでのX線結晶構造解析では、DNA切断を行う状態でのHNHドメインの位置は明らかとなっていなかった。その為、DNA切断を行う状態を含めたHNHドメインのダイナミクスを明らかとした点で、本研究成果は非常に意義深い物である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
これまでに於いて１分子レベルでCas9のタンパク質分子内構造ゆらぎを直接可視化する事に成功しており、従来のX線結晶構造解析では得られていなかったDNA切断時に於けるヌクレアーゼドメインであるHNHドメインの挙動を直接、可視化する事に成功した。本研究成果は共著論文Osuka et al. EMBO (doi: 10.15252/embj.201796941)として論文発表が行われ、東京大学よりプレスリリースが行われた。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究によりCas9がターゲットDNA配列を認識する際のタンパク質分子内構造変化を可視化する事に順調に成功している。今後は引き続き、１分子FRET計測法を用いてCas9分子によるターゲットDNA配列認識、切断機構の可視化を行うと共に、１分子FRET計測法の弱点である時間分解能の点を克服する為に、新たな実験手法を導入しても計測する予定である。また他種Cas9を用いても計測を行う事で、これまでに観察されているCas9分子内構造ゆらぎがCas9全般で普遍的に観察される現象か否かの検討を行なっていく事を予定している。
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| Causes of Carryover |
米国で開催される国際学会に参加して研究成果発表を行う予定であったが、所属研究室の引越しと学会の日程が重なり、参加出来なくなった為に、旅費分が残額として生じた。平成30年度に於いては、平成29年度に得られた研究成果を含めて国際学会にて発表を行う予定である。
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