2019 Fiscal Year Annual Research Report
Clarification of Cas9"s target DNA recognition mechanisim.
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17K15100
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
小森 智貴 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 客員共同研究員 (50542289)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / 1分子計測 / FRET |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ゲノム編集タンパク質Cas9はターゲットDNA配列を認識して、切断する事で任意の部位でのDNA配列の編集を可能とするタンパク質である。Cas9がDNA切断活性を有する事が知られている一方で、Cas9がDNA配列を切断する際の詳細な分子機構は未だに解明されていない。また、Cas9のDNA配列の認識特異性は比較的高い一方で、認識配列以外のDNA配列を認識・切断してしまうオフターゲット活性が依然として問題として残っていた。本研究においてはまずCas9が切断活性を示す際のCas9上のDNA切断活性を有するHNHドメインの動きを１分子レベルで直接可視化する事で、HNHドメインはDNA切断時に静的な構造状態をとるのでは無く動的な構造状態を取る事が重要である事を明らかにした(Osuka et al. EMBOJ. 2019)。また本研究に用いられた１分子計測手法は技術論文としてまとめ、プレプリントサーバに公開している（Narita et al. BioRxiv 2020）。これまでの研究により、Cas9の切断活性にはHNHドメインの構造状態の揺らぎが切断活性に重要である事が示唆された事から、オフターゲット活性は間違った配列が結合したにも関わらず、HNHドメインの構造のゆらぎを増加させてしまう事から引き起こされていると推測された。その為に、ターゲット配列結合以外にはHNHドメインが動的な構造状態を取らないように、Cas9の構造安定性を上昇させる事でオフターゲット活性を抑える事が出来る可能性が示唆された。また、本研究ではCas9に類似した分子機構を有すると期待できるアルゴノートタンパク質にも研究展開を行い、アルゴノートタンパク質のN末端領域が活性制御に重要な役割を示す可能性を示した（Narita et al. 投稿準備中論文 2020）。
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