2017 Fiscal Year Research-status Report
Investigation of molecular mechanisms underlying environment-dependent regulation of ion permeation through mammalian potassium channels.
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17K15109
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| Research Institution | Institute for Molecular Science |
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Principal Investigator |
塚本 寿夫 分子科学研究所, 生命・錯体分子科学研究領域, 助教 (90579814)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | イオンチャネル / 赤外分光 / リポソーム / 蛍光分光 / 膜タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成29年度は、哺乳類の心房や心室の細胞などにおいて、ナトリウムイオンの「漏れ」電流を生じさせることで静止膜電位を調節するカリウムチャネルTWIK-1について赤外分光解析と生化学的解析をメインに行い、機能制御メカニズムを明らかにした。ほとんどのカリウムチャネルはイオン選択性が極めて高く、ナトリウムイオンは透過しない。しかしTWIK-1は前述のようにナトリウムイオンも透過し、そのイオン透過性は環境に応じて変化することも知られていた。
まず、哺乳培養細胞で大量発現させたTWIK-1を精製し、脂質小胞リポソームに再構成し、蛍光インジケータACMAを用いてイオン透過性を評価した。その結果、TWIK-1の野生型はそのチャネル自体が低いイオン選択性を持つことを明らかにし、T118I, L228F変異体は野生型よりも高いイオン選択性を示すことも確認できた。そして、TWIK-1の野生型およびT118I, L228F変異体について、外部のイオン環境を変化させた時の赤外吸収スペクトル変化をATR-FTIR（全反射赤外分光法）を用いて解析した。その結果、カリウム条件において1680cm-1のバンドを細菌由来のカリウムチャネルKcsAと同様に見出した。このバンドは、カリウムチャネルに特異的なイオン選択フィルタとカリウムイオンとの相互作用を反映していると考えられた。さらに、カリウム濃度とナトリウム濃度の量比を様々に変化させた際の1680cm-1のバンド変化量から、TWIK-1では、選択フィルタ部位とカリウムイオンとの結合親和性が大きく低下していることを示す結果を得た。また外部のイオン種を様々に置換した実験などから、TWIK-1では選択フィルタの形状がイオン種を変化させても変化しにくいことも見出した。これらの機構によって、TWIK-1のイオン選択性が低く制御されていると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成29年度は、TWIK-1について詳細な赤外分光解析を行うことで、タンパク質外の環境を変化させた時のこのチャネルの構造変化を明らかにすることができた。また精製したTWIK-1タンパク質を用いて、そのイオン選択性を簡便に調べるアッセイ系を確立し、このチャネルが他のタンパク質からの間接的な影響がなくても、カリウム選択性が低くなっていることを確認できた。TWIK-1はカリウムチャネルとしては珍しくカリウム選択性が低いが、その結晶構造が明らかにされても、どのようにイオン選択性を低めているのかはわかっていなかった。平成29年度の解析から、この謎に一つの回答を提供することができ、得られた知見をJ. Biol. Chem.誌に発表した。このように、赤外分光解析によってTWIK-1の環境依存的な構造変化を明らかにし、その機能制御メカニズムを解明することは、予定通り進めることができた。
その一方で、TWIK-1が細胞外環境を感知するために重要であると考えられている細胞外ドメインの環境依存的な構造変化を、部位特異的蛍光標識によって解析する計画については、精密な赤外分光解析を時間をかけて行う必要があったため、予定していたレベルでは進捗させることができなかった。しかし、研究計画立案時には予定していなかったが、名古屋大学の内橋貴之教授グループとの共同研究によって、高速原子間力顕微鏡を用いてTWIK-1の細胞外ドメインの形状を一分子レベルで解析することに成功した。「今後の研究の推進方策」で述べるように、来年度は蛍光標識と高速原子間力顕微鏡解析を組み合わせることで、TWIK-1の細胞外ドメインの環境依存的な構造変化についても解析を進めることができると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、赤外分光解析に加えて部位特異的蛍光標識と高速原子間力顕微鏡を組み合わせた解析によって、TWIK-1の細胞外ドメインが外部の環境変化によってどのようにその構造を変えるのかを解析する。得られた結果により、実際にTWIK-1の細胞外ドメインが細胞外環境の認識に関わっているのかどうかを明らかにする。さらに、TWIK-1だけでなく、環境依存的なチャネル活性の変化を示す他の哺乳類カリウムチャネル（具体的には、大量発現・精製することにすでに成功しているKir3.2を想定している）についても、平成29年度TWIK-1に対して行ったような赤外分光解析を適用することで、カリウムチャネルの種類ごとに、イオン選択性などのチャネル機能の制御機構がどの程度類似あるいは異なっているのかを明らかにしていく。
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| Causes of Carryover |
「現在までの進捗状況」および「今後の研究の推進方策」で述べたように、TWIK-1に対する部位特異的蛍光標識を用いた解析を、主に平成３０年度に行う予定になったため、その遂行に必要な助成金額分を平成３０年度に使用することにする。
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