2018 Fiscal Year Research-status Report
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17K15112
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| Research Institution | Ritsumeikan University |
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Principal Investigator |
萬年 太郎 立命館大学, 生命科学部, 助教 (50535763)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 核内構造体 / ncRNA / DBC1 / プロテオミクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質情報を持たないノンコーディングRNAを骨格として形成される核内構造体(核内RNA顆粒)が重要な生理機構に関与していることが近年明らかになってきている。核内RNA顆粒はRNA-タンパク質相互作用を介して形成されることから、これらの生理機構を解明するためには骨格となるRNAのみではなく構成因子やその形成機構を明らかにすることが重要となってくる。
本年度は、昨年度にFLAGタグ融合DBC1を免疫沈降した後にRNase処理をおこないLC-MS/MSにより同定したRNA依存的にDBC1と相互作用する5つのタンパク質(DIRBP : DBC1 interacting RNA binding protein A, B, D, E, F)について詳細な解析をおこなった。まず、これらのタンパク質についてFLAGタグ融合DBC1を免疫沈降したサンプルをWestern blottingで相互作用を確認したところ、RNase処理によりDBC1との相互作用が消失もしくは減少した。次に、免疫染色によって細胞内局在を観察したところ、DIRBP_AとBについてはDBC1ボディと共局在していた。また、RNAポリメラーゼ阻害剤により、DBC1ボディの消失とともにこれらの局在も消失していた。このことから、DBC1ボディの新規構成因子としてDIRBP_AとBを同定することができた。現在、DIRBP_AとBがDBC1ボディの形成・維持にどのように関与しているかを解析するため、これらの因子のsiRNAをおこなっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はLC-MS/MS解析により同定した因子の中から、western blottingや免疫染色によりDBC1ボディの新規構成因子を同定することができた。また昨年度に至適化をおこなっていたRNAポリメラーゼ阻害剤を用いた解析も使用することができた。これらの成果から、ほぼ計画通りに進行できたと評価できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はDBC1ボディの新規構成因子がDBC1ボディの形成・維持にどのように関与しているかをsiRNAやプラスミドによるレスキュー実験などにより解析することで、DBC1ボディの生理機能を解明していきたい。
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| Causes of Carryover |
今年度は、DBC1ボディの新規構成因子の同定をすることができたが、候補因子が複数存在したためその機能解析に使用するsiRNAや抗体を数回分の小容量を購入したため、次年度使用額が生じた。次年度はDBC1ボディの新規構成因子の詳細な機能解析を行っていくつもりである。そのため、次年度使用額は追加のsiRNAや抗体を購入するために使用するつもりである。
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Research Products
(7 results)
