2017 Fiscal Year Research-status Report
O型糖鎖修飾能を強化するゴルジ体ストレス応答の転写制御機構
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17K15122
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
佐々木 桂奈江 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 学振特別研究員(PD) (80752427)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ストレス応答 / ゴルジ体 / 糖鎖修飾 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ゴルジ体ストレス応答とは、ゴルジ体の処理能力を超える事態に対して、能力を増強することで恒常性を維持する、細胞の生命活動に必須の適応機構である。本研究では、ゴルジ体でO型糖鎖修飾されるプロテオグリカンに焦点を当て、O型糖鎖修飾の能力を増強させるストレス応答機構を解明することを目的とし、以下の実験を行った。
プロテオグリカンの糖鎖修飾阻害剤xylosideで処理したHeLa細胞のマイクロアレイ及び次世代シークエンサー解析を行ったところ、複数のプロテオグリカンO型糖鎖修飾酵素遺伝子 (CSGALNACT2, GLCE, HS6ST1, HS3ST1, NDST2, B3GAT3) の発現上昇がみられた。また、これらの遺伝子はプロテオグリカンのコアタンパク質の過剰発現によっても発現が上昇した。さらに、これらの遺伝子の発現は既知のゴルジ体ストレス応答経路（TFE3, HSP47, CREB3経路）非依存的に制御されることが判明した。
それぞれの遺伝子の転写開始点から上流1 kbp以内の領域をレポーターであるルシフェラーゼ遺伝子につなぎ、それらの欠損・置換変異コンストラクトを導入したHeLa細胞でルシフェラーゼアッセイを行い、プロモーターを解析した。その結果、GLCE, HS6ST1, NDST2, B3GAT3において転写制御に重要なエンハンサー配列を同定し、GCリッチな共通配列が含まれていたことから、この配列をproteoglycan stress response element (PGSE) とした。これらの結果から、ゴルジ体ストレス応答の新規転写制御配列を明らかにすることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題を遂行するために、一年目にゴルジ体ストレス応答遺伝子の転写制御配列及び転写因子の同定、二年目に転写因子の活性化機構など上流経路の解析を行い、ゴルジ体ストレス応答の新規経路の全容を明らかにする予定であった。 今年度は当初の予定通り、プロテオグリカンのO型糖鎖修飾能力を増強させるストレス応答の転写制御配列PGSEの同定に成功した。PGSEに結合する転写因子を同定するために、酵母one hybrid法を行ったが、現在までに有力な転写因子候補は得られていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
PGSEに結合する転写因子を同定するために、酵母one hybrid法に加えて、以下の方法も予定している。
ビオチン標識したPGSEと核抽出液を用いてゲルシフトアッセイを行い、結合因子の存在を確認後、プルダウンアッセイを行い、質量分析にて転写因子を同定する。
CRISPR-Cas9システムを用いたスクリーニングにより、ゴルジ体ストレス応答の制御因子を同定する。
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