2017 Fiscal Year Research-status Report
微小管局在型エフェクター、PH15を介した植物固有型RAB5の機能発現機構の解明
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17K15144
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| Research Institution | International Christian University |
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Principal Investigator |
中村 瑛海 (伊藤瑛海) 国際基督教大学, 教養学部, 特任助教 (80726422)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 膜交通 / RAB5 / エフェクター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生命の基本単位である細胞のなかは、生体膜によりオルガネラと呼ばれるコンパートメントに区画化され、オルガネラ間では「膜交通」を介した物質や情報のやり取りが行われている。膜交通制御を担うRAB GTPaseは真核生物に広く保存されているが、陸上植物と一部の緑色藻類は保存型RAB5に加え、植物固有型のRAB5を有する。申請者は、植物固有型RAB5の機能実行因子（エフェクター）の候補として「PH15」タンパク質を同定した。本研究課題では、植物独自の膜交通・オルガネラ機能におけるPH15の役割を理解するため、（１）ph15変異体やPH15過剰発現体が膜交通やオルガネラ機能に与える役割を評価するとともに、（２）PH15と植物固有型RAB5の相互作用因子の時空間的情報を理解し、（３）PH15が結合するリン脂質種を明らかにする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２９年度の計画では、ph15変異体やPH15過剰発現体が膜交通やオルガネラ機能に与える役割を評価するため、まずPH15にT-DNA挿入のある変異体をArabidopsis Biological Resource Centerから購入し、野生型と３回戻し交雑を行い、ph15変異体を確立した。そして、ph15変異体背景でGFP融合PH15やARA6-GFP、他のオルガネラマーカーが発現する植物の作出を行った。また、PH15とARA6の相互作用をイメージングするため、Addgene社よりBiFC解析用のベクターを購入し、タバコの一過的発現系による解析を行った。そして、PH15精製タンパク質を回収するためのコンストラクトを作成し、条件検討を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成３０年度は、まず（１）作成した可視化ラインの観察を行う。平成２９年度の研究からPH15は根端分裂組織の静止中心付近で発現することを明らかにした。この様子を詳細に観察するとともに、ClearSee法などにより根の組織深部におけるオルガネラ動態の観察を試みる。（２）については、予備的な解析によりPH15とARA6がヌクレオチド依存的に相互作用することを、一過的発現系により明らかにする。また今年度は予定通りPH15が結合するホスホイノシチド種を生化学的な手法により明らかにする。
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| Causes of Carryover |
平成２９年度の研究から、PH15が根端分裂組織の深部で特異的に発現することが明らかになった。そのため、研究計画１で予定していた研究内容を遂行するにあたって、より精度の高い顕微鏡システムを使用する必要性が生まれた。平成３０年度は先端バイオイメージング支援プラットフォーム（ABiS）への申請し高精度のイメージングを試みるため、ABiSへの旅費やClearSee解析に必要な試薬費が発生した。
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