2017 Fiscal Year Research-status Report
Deciphering developmental signal intertwined with primary metabolism by trans-omics approach
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17K15147
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| Research Institution | Okazaki Research Facilities, National Institutes of Natural Sciences |
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Principal Investigator |
川出 健介 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(岡崎共通研究施設), 岡崎統合バイオサイエンスセンター, 特任准教授 (90612086)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | トランスオミクス / レドックス状態 / 細胞増殖 / 一次代謝 / シグナル伝達 / 低酸素応答 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本課題は、ロイシンに高感受性を示して発生停止するan3変異株を調べることで、一次代謝と発生の有機的なつながりを分子レベルで解明することを目的としている。そこでまず、野生株とan3変異株の芽生えを用いて、RNA-seqとメタボロミクスに取り組んだ。得られた各オミクスデータを統計・情報科学的に解析したところ、an3変異株ではロイシン分解経路に異常がみられる点と、恒常的に低酸素応答を示している点が示唆された。そこで、ロイシンの分解中間産物をLC-MS/MSで分析したところ、たしかに蓄積量が減少していた。また、活性酸素種を検出する試薬でレドックス状態を調べたところ、an3変異株ではレドックス状態に変化があることが分かってきた。興味深いことに、この変化に対応して、細胞増殖活性も変化している。現在は、より高精度にレドックス状態を調べられる各種レポーター系統の作出を進めている。さらに、タンパク質分解経路の異常により低酸素応答を恒常的に起こしている変異株を入手し、ロイシン感受性を検討した。その結果、これらの変異株でもan3変異株と同じく高感受性を示すことが分かった。この結果は、AN3シグナルとタンパク質分解経路に未知の関連があることを示唆している。そこで、これら系統の代謝プロファイルをメタボロミクスで解析する準備を進めているところである。なお、当該年度中には、葉における細胞増殖活性の時空間分布を決めるAN3シグナルについて論文として公刊させた（Kawade et al., 2017）。この成果に、上記の予備的な知見を含めて考えると、細胞増殖とレドックス状態のバランスをAN3シグナルが保っているという仮説が考えられる。このバランスは細胞の生理状態を考えると必須であるが、未だに不明な点が多い。したがって、本課題を進めることで、未開拓の課題にアプローチできると考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
タンパク質分解経路の異常により低酸素応答を恒常的に示す変異株は発芽率が非常に低く、実験に用いるための条件検討に時間がかかった。さらに、an3変異株でみられた特徴的な代謝プロファイルをLC-MS/MSで確認するための実験条件も、定まるまで時間がかかった。これらは多面的に検討することで当該年度中に解決することができたが、研究遂行の律速になった。
ただ、トランスクリプトーム解析とメタボローム解析を行い、an3変異株で見られる代謝応答異常の原因について既に絞り込むことができた。そして、AN3シグナルとレドックス調節という興味深い仮説が浮かび上がってきた。この成果は、これから研究を発展させていくうえで非常に重要な基盤情報となる。また、それを踏まえ、詳細な解析に必要なレポーター系統などの作成にも取りかかることができている。さらに、関連するAN3シグナルの論文を公刊できたので、研究の遂行がより円滑になると期待できる。これらと並行して、葉の発生で見られる核内倍加について、それが起こる頻度を定量的に説明する理論モデルを提案することもできた（Kawade and Tsukaya, 2017）。これは当初の計画には無かった成果であり、活発に他分野と連携しながら本課題を進められていることを示す好例だと考えている。このような進展から、本課題はおおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、レドックス状態を調べる各種レポーター系統の確立を進め、an3変異株における活性酸素種の分布変化や、その蓄積量の変化を定量的に評価する。そして、これまで用いてきた活性酸素種を検出する試薬と相互補完的に調べ、an3変異株におけるレドックス状態について確定的なデータを出す。さらに、その変化が細胞増殖活性の変化を引き起こすのかどうか、作成を進めているAN3遺伝子誘導系統を用いて明らかにする。さらに、低酸素応答を恒常的に起こしている変異株についてメタボロミクスを行い、an3変異株と同様の代謝プロファイルを示すのか検討する。それと並行して、an3変異株との二重変異株の作成を進め、当該タンパク質分解経路とAN3シグナルの転写および代謝レベルでの関係を分子遺伝学的に調べる。さらに、an3変異株で特徴的に蓄積量が変化している代謝物を同定し、それらを培地に投与することで、an3変異株における細胞増殖の欠損が回復するのか検討する。
加えて、タンパク質分解の恒常性には窒素代謝が大きく関わることから、栽培培地中の窒素濃度を変えてan3変異株を生育させ、細胞増殖活性を評価するという実験も行う。それに対応させて、AN3自身、またはトランスクリプトーム解析で遺伝子発現量に変化のあった遺伝子の応答性を調べることで、AN3シグナルの環境応答性という方向性でも研究を展開できるか検討を進める。
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| Causes of Carryover |
再現性のよい実験系を確立できたことにより、RNA-seqに供するサンプル数を抑えることができた。それにより、経費を節約することができた。今後はこの結果を受けて、より詳細な解析に取り組む予定である。現在は、そのために必要な各種レポーター系統などの作出を進めているため、この節約できた経費分で、必要となる分子生物学的な実験試薬を購入する。それにより、全体として整合性のとれた適切な助成金の執行を進める。
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