2020 Fiscal Year Annual Research Report
Molecular imaging of PI3P in the plant type autophagosome
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17K15148
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| Research Institution | National Institute for Environmental Studies |
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Principal Investigator |
大田 修平 国立研究開発法人国立環境研究所, 生物・生態系環境研究センター, 特別研究員 (20455926)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 藻類細胞 / 重金属ストレス / 関節蛍光抗体法 / オートファジー / ホスファチジルイノシトール３リン酸 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
オートファジー（ATG）は栄養塩飢餓や環境ストレスに応答する細胞内機構であり、真核生物において進化的に広く保存されている。ATG機構は哺乳類細胞や酵母細胞において詳しく研究されているが、陸上植物や藻類細胞の知見は少なく、これらのグループにおける知見の蓄積が重要である。本研究ではATG上流で機能する脂質分子ホスファチジルイノシトール３リン酸（PI3P）分子の細胞内動態に着目し、間接蛍光抗体法にもとづく可視化法の検討やフローサイトメトリー解析を行った。
本研究では，PI3Pに特異的に結合するPXドメインをもつタンパク質（p40phox）を精製し、これを利用したPI3P分子の細胞内動態をフローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡観察により詳しく調べた。本年度はフリーズフラクチャー法による電子顕微鏡観察での十分なデータは得られなかったものの、蛍光顕微鏡やフローサイトメトリーによるデータを収集することができた。ストレス付与実験においてラパマイシンや重金属によりATGが惹起され、細胞内PI3P量が増加することが確認された。この条件下で間接蛍光抗体法を利用した分子イメージングにより、細胞内のPI3P分子局在解析を行ったところ、顆粒状の構造やリング状構造が観察された。同様に、細胞内の酸性コンパートメントを生体染色するLysoTrackerを用いて蛍光観察を行ったところ、p40phoxと同様の顆粒状の構造やリング状構造が確認され、ATG構造の可視化系を確立できた。今後は、本研究で確立された分子イメージング手法により藻類細胞のストレス応答による細胞形態、微細構造の詳細な比較解析を進めたい。
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