2017 Fiscal Year Research-status Report
TCA回路の進化起源は炭酸固定代謝なのか、逆進化実験で解き明かす
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17K15166
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
亀谷 将史 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 助教 (80748517)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | TCA回路 / 祖先型酵素 / 代謝進化 / 炭酸固定 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度はまず、本研究で対象とした還元的TCA回路中酵素3種の祖先型酵素を構築した。すなわち、現存酵素のアミノ酸配列に基づいて祖先型酵素のアミノ酸配列を推定し、大腸菌内で発現可能になるような人工遺伝子を合成し、大腸菌で異種発現させ、発現した祖先型酵素を大腸菌から精製する、という実験を行った。本年度構築を試みた3種について、いずれも大腸菌で可溶性発現する酵素が得られた。本実験ステップで可溶性酵素の発現が見られない可能性が本研究計画の懸念として当初考えられていたが、今後の研究遂行に支障のない実験経過が得られたと言える。また、3種の酵素はいずれも複数種のサブユニットからヘテロ複合体を形成するという点で、これまで祖先型酵素構築が試みられてきた酵素の多くと異なる。本研究で用いた祖先型構築という研究手法がヘテロ複合体を形成するタンパク質にも適用可能であることを示す知見と言える。この結果を受けて、サブユニットごとでアフィニティ精製用タグの有無を変えた祖先型酵素の構築も行っており、今後さらに詳細な祖先型サブユニット間相互作用が明らかになることも期待される。得られた祖先型酵素については活性測定も行った。3種類の酵素の内2種は活性を示し、いずれも本研究の作業仮説を指示するような反応の触媒活性が観察された。今後は酵素の精製度や活性測定条件を改善した上で、より詳細な酵素動力学的解析を行うことで各祖先型酵素の性状を明らかにする予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画調書に記載の通り、対象とした酵素種について祖先型タンパク質配列の推定・人工合成・また大腸菌での異種発現を行った。各酵素種について可溶性発現した酵素が得られており、今後の研究遂行に支障のない実験材料が得られたと言える。また得られた酵素についても活性測定実験を行い、各祖先型酵素が活性を有しているか、また活性を有している場合どの反応の触媒活性を有するかも評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに活性の検出された2種の祖先型酵素に関しては、酵素の精製度や活性測定条件を改善した上で、より詳細な酵素動力学的解析を行うことで各祖先型酵素の性状を明らかにする予定である。また、活性の得られていない1種の祖先型酵素に関しては、嫌気条件での発現・精製を行うことで活性型酵素が得られないかを試みる予定である。また、得られた酵素を用い、結晶構造解析を試みる予定である。
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| Causes of Carryover |
研究計画調書提出時に計画していなかったこととして、研究代表者は9月1日に所属機関を異動した。異動前の実験に必要な物品は、本科研費交付内定前に購入済みだったもので支障がなく、物品移動による酵素失活や破損などのトラブルを避けるように努めた。異動後は、実験のセットアップに時間を要したことや予定していた学会参加を見送ったことなどから、次年度使用額として回すこととなった。当該年度で使用を見送っていたDNA実験用試薬やタンパク質実験用試薬の購入、また国内外学会の参加に次年度使用する予定である。
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