2017 Fiscal Year Research-status Report
細胞内Mg2+濃度とリボソームの相関関係解明と応用
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17K15253
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| Research Institution | Rikkyo University |
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Principal Investigator |
赤沼 元気 立教大学, 理学部, 助教 (30580063)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | Ribosome / Magnesium |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度はまず、枯草菌リボソームタンパク質遺伝子の欠損株において、70Sリボソームの形成量や増殖速度に対する細胞内Mg2+濃度増加の効果を検証した。リボソームタンパク質L1, L23, L36, S6をそれぞれ欠損した株では70Sリボソーム形成量の低下とそれに伴う細胞増殖速度の低下が観察される。これらの株の細胞内Mg2+濃度を、Mg2+取り込みポンプ（MgtE）の高発現と、Mg2+排出ポンプ（YhdP）の欠損によって人為的に増加させることに成功した。その結果、全ての欠損株で70Sリボソーム形成量の回復が認められた。また、L1, L23欠損株では細胞増殖速度の回復が、L1欠損株では胞子形成能の回復がそれぞれ観察された。これらの結果は、恐らく70Sリボソームの構造安定化という点において、リボソームタンパク質機能の一部がMg2+によって相補可能であることを示すものである。
その一方で、細胞内Mg2+濃度を過剰に引き上げる系の確立にも成功した。MgtEにMg2+の取り込みを促進させる変異を導入した上で高発現させ、さらにYhdPを欠損させた株を、Mg2+を添加した培地で培養することで、通常の1.5倍程度の濃度まで細胞内Mg2+濃度を引き上げた。この異常なMg2+濃度の向上は、細胞増殖速度の低下を引き起こしたが、rRNAオペロンの転写量はむしろ増加していた。Catの翻訳量から推定すると、Mg2+過剰時には細胞内翻訳活性が低下することが示唆された。さらに、mgtEを含むMg2+取り込みポンプをコードする遺伝子の３重破壊株を構築し、その株の増殖が培地へのMg2+添加に依存することを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画調書では具体的な検討課題として以下の５点を挙げているが、すでに検証を終えている課題もあり、概ね計画通りと言える。１．生育段階におけるリボソーム量変動とMg2+濃度の相関性；非胞子形成培地であるLB培地と胞子形成培地である2 x SG培地でそれぞれ培養した枯草菌の細胞内Mg2+濃度を観察し、定常期に細胞内Mg2+濃度とリボソーム量が低下することを見出した。２．細胞内Mg2+濃度操作によるリボソーム量、新規合成量、翻訳活性への影響検証；細胞内Mg2+濃度を過剰/枯渇させる系の確立に成功した。Mg2+過剰条件下では翻訳活性が低下すること、新規合成量は通常の条件と比較して増加することがこれまでの結果から示唆されている。３．リボソーム変異株における70S形成量やリボソームの安定性に対する細胞内Mg2+濃度増加の効果；L1, L23, L36, S6をそれぞれ欠損した株の細胞内Mg2+濃度向上が、70Sリボソーム形成量を回復させることを証明した。４．細胞内Mg2+枯渇時のリボソーム分解と遊離Mg2+濃度変化の観察；細胞内Mg2+を枯渇させる系の確立に成功し、Mg2+の枯渇によって細胞増殖が停止することを確認した。５．細胞内Mg2+濃度操作による枯草菌の有用物質生産量増加；物質生産量への効果は検証していないが、細胞内Mg2+濃度を操作する系の確立に成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞内Mg2+濃度を過剰にすることで、リボソーム量とその安定性にどのような影響を与えるのかを検証する。このとき、rRNAの転写量が増加することを確認しているが、リボソームタンパク質遺伝子の転写量変動についても観察することで、リボソームの新規合成量をモニターする。一方、細胞内Mg2+を枯渇させた条件でのリボソーム量と安定性、rRNAとリボソームタンパク質遺伝子の発現量を観察する。リボソームの分解が観察された場合、そのメカニズムについても明らかにする。また、細胞内の遊離Mg2+濃度をモニターする系を構築する。これには、Mg2+リボスイッチを持つmgtE上流域にlacZを融合した遺伝子を枯草菌ゲノムに導入する予定である。以上の解析について、rRNAオペロンのコピー数を制限した株でも行い、野生株と比較する。通常、枯草菌ゲノム上に10コピー存在するrRNAオペロンを2コピーまで欠失させた株を用いることで細胞内リボソーム量を制限し、Mg2+の枯渇と過剰に対する細胞の適応に、リボソーム量の変化がどのように影響するのかを検証する。
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| Causes of Carryover |
380,000円程度の次年度使用額が発生した理由として、試薬・酵素類の購入額が少なかったことが挙げられる。
H30年度は、1,180千円の超低温フリーザーを購入する予定である。またH29年度未使用額と併せて、試薬・酵素類などの消耗品を購入するとともに、英文校閲料や論文投稿料に助成金を使用する予定である。
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Research Products
(1 results)
