2017 Fiscal Year Research-status Report
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17K15257
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
桝尾 俊介 筑波大学, 生命環境系, 助教 (10767122)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ピラジン環 / ジヒドロビラジン酸化酵素 / アセチル基転移酵素 / メチル基転移酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
pfpapDEFがコードするタンパク質はglycine C-acetyltransferase、methyltransferase、glycine oxidaseとそれぞれ相同性を示す。これまでの検討から、本経路の生産中間体として3-アミノ-4-(4-アミノフェニル)-2-ブタノン(APB)を見出している。
[PfPapD]組換え酵素を用いた解析から、本酵素が4APheの脱炭酸とアセチルCoAからのアセチル基の転移を触媒し、APBと思われる化合物を生成する活性を有することを見出していた。今回、酵素反応産物を精製後、NMR解析を行い、PfPapD反応産物がAPBであることを確認した。また、酵素反応により生じる遊離のCoAをエルマン試薬と反応させることで比色定量する系を構築した。これにより酵素反応速度論的解析を効率的に行うことが可能となった。
[PfPapF]グリシンを基質とした際のUV/Visスペクトル解析から、本酵素が電子受容体として酸素を利用することを明らかとした。HRPとo-dianisidineを用いたカップリング反応により、酵素反応により生じた過酸化水素を定量する系を構築した。精製したAPBを嫌気条件下で縮合させ、ジヒドロピラジンを調製した。APBあるいはジヒドロピラジンを基質として酵素反応を行ったところ、PfPapFはジヒドロピラジンに対して活性を示した。本酵素はジヒドロピラジンを酸化し2,5-ジメチル-3,6-ビス(4-アミノベンジル)ピラジン（DMBAP）を生成するFAD依存酸化酵素であることが示された。
[PfPapE]本酵素がS-アデノシルメチオニンを用いてDMBAPをメチル化することが確認できた。LC-MS/MS解析により、反応産物はDMBAPのアミノベンジル基がメチル化されたものであることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
不明な部分の多かったPfPapFの基質が明らかとなり、生合成経路の全貌が見えてきた。今年度の研究成果により酵素反応速度論的な解析も可能となった。これらを明らかとすることで、より詳細な生合成メカニズムが明らかとなると期待される
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| Strategy for Future Research Activity |
各酵素について、速やかに酵素反応速度論解析を行い、その諸性質を明らかとする。今年度の成果を基に、他の生物由来のPapDF様タンパク質の解析も同様に進める。
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| Causes of Carryover |
当該年度内に全ての微生物株の入手および人工遺伝子合成を行う予定であったが、一部を除き、次年度にこれを執行することとしたため。次年度前半には菌株および遺伝子の選定を終え、年度内に前年度の予算を執行する。
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