2017 Fiscal Year Research-status Report

酵素学的研究によるホスファチジン酸のde novo合成を担う分子基盤の解明

Research Project

Project/Area Number	17K15259
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	小川拓哉京都大学, 化学研究所, 助教 (40756318)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2019-03-31
Keywords	アシルグリセロールリン酸アシル基転移酵素 / PlsC / 変異解析 / 阻害剤開発
Outline of Annual Research Achievements	細胞膜リン脂質の前駆体であるホスファチジン酸 (PA) は、真核生物・真正細菌を問わずアシルグリセロールリン酸アシル基転移酵素 (AGPAT) によってde novo合成される。AGPATは膜内在性タンパク質であるために精製が極めて難しく、これまで酵素学的な知見が乏しかった。以前の研究において、低温性細菌Shewanella livingstonensis Ac10由来の細菌型AGPAT (以下、PlsCと表記) を活性を保ったまま精製することに成功し、基質特異性などの反応特性を明らかにした。この結果に基づき、AGPAT/PlsCの反応機構解析を目的として平成29年度は以下の実験を行った。 1) 平成29年8月に他の研究グループによって好熱菌由来のPlsCの結晶構造が報告された。これを鋳型としてS. livingstonensis Ac10のPlsCの立体構造モデルを計算し、本酵素の特徴である不飽和脂肪酸特異性を決定するアミノ酸残基について同モデル構造から検討付けを行い、変異解析を行った。変異型酵素は作製済みであり、現在、それらの基質特異性について解析を進めている。 2) PlsCの精製方法に基づき、精製酵素の特性が未解明である真核生物のAGPATの異種発現および精製に取り組んだ。ヒトおよびマウスのAGPATについて大腸菌Escherichia coliを宿主とした発現系を構築し、培養条件の検討やコドンの最適化などを通して異種発現を試みたが、微量に発現するにとどまった。 3) 安定性の低いS. livingstonensis Ac10 PlsCの結晶構造解析を目指して、PlsC阻害剤の開発に取り組んだ。京都大学化学研究所の竹本靖助教に化合物ライブラリーを供与していただき、PlsCによるPA合成反応の阻害を指標に一次スクリーニングを行ったところ、阻害活性を示す複数のヒット化合物を得た。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 平成29年8月に他の研究グループによって好熱菌由来のPlsCの結晶構造が報告され、AGPAT/PlsCによるアシル基転移反応の基礎的な分子機序が提唱された。これを受け、本研究課題で当初計画していたS. livingstonensis Ac10 PlsCの反応機構解析および結晶構造解析を一旦凍結し、本酵素の阻害剤開発などに着手したため。
Strategy for Future Research Activity	前述の研究実績 1) ~ 3) に基づいて、つぎのように研究を進める。 1) 作製したS. livingstonensis Ac10 PlsCの変異型酵素と種々の脂肪酸アシル-CoAとの反応性を分析し、未解明のAGPAT/PlsCによる基質選択性について知見を得る。 2) ヒト/マウスAGPATを精製して諸性質を分析するには、現在の発現量では不十分であることが予想される。そこで、ヒトやマウスと同じ真核細胞である酵母を宿主とした発現系に切り替えることでタンパク質収量の改善を試みる。その後、PlsCの精製方法を適用して精製し、機能解析を行う。 3) 一次スクリーニングで得られたヒット化合物について、構造活性相関を考慮しながら二次スクリーニングを展開し、より阻害活性の高い阻害剤の開発を目指す。また、ヒト/マウスAGPATに対する阻害活性を試験し、抗菌薬としての利用価値を検討する。
Causes of Carryover	前述のとおり、本研究課題で計画していたS. livingstonensis Ac10 PlsCの反応機構解析および結晶構造解析を一旦凍結したことで、当初想定していた試薬および物品を購入しなかったため、次年度使用額が生じた。平成30年度はAGPAT/PlsCの発現系構築と精製、機能解析、および阻害剤開発を重点的に進め、それらの実験に必要な試薬・物品の購入費として使用する。また、得られた成果を発表するにあたり必要となる学会旅費、論文投稿料に使用する。