2018 Fiscal Year Research-status Report
順遺伝学および逆遺伝学的手法を用いた外生菌根菌ホンシメジの共生研究基盤の開発
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17K15287
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| Research Institution | The University of Shiga Prefecture |
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Principal Investigator |
泉津 弘佑 滋賀県立大学, 環境科学部, 助教 (20579263)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 外生菌根菌 / アグロバクテリウム法 / 遺伝子破壊 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度の研究計画は、昨年度までに作出した外生菌根菌ホンシメジのKU80破壊株を親株として、菌根共生や子実体形成に関与していると予測される各遺伝子群の破壊をすすめることであった。そこで、3種のMAPキナーゼ（LsCHK1, LsMPK1, LsHOG1）およびPKA（LsPKA1）の破壊を試みた。その結果、LsCHK1の破壊試験では8株のノーセオスリシン耐性株が得られ、7株が遺伝子破壊株であった。LsHOG1の破壊試験では2株のノーセオスリシン耐性株が得られ2株どちらも破壊株であった。LsMPK1については、昨年度に3株の破壊株を取得していたが、今年度あらたに１株の破壊株を作出した。LsPKA1についてはノーセオスリシン耐性株を得ることができなかった。
これらのうち、LsMPK1破壊株は野生株とは大きく異なり、培地上において気中菌糸をほとんど形成していなかった。また、LsCHK1破壊株においても気中菌糸の減少がみとめられた。これらの表現型については、次年度に詳細に調査する予定である。
野生株を親株としたKU80遺伝子の破壊試験では遺伝子破壊効率（破壊株／薬剤耐性株）はわずか0.3%(1株/363株)であったが、KU80破壊株を親株とした遺伝子破壊試験の遺伝子破壊効率は合計で93%（13株/14株）と飛躍的な向上が認められた。これらの結果は、近年、数種の担子菌類で報告されているものと同様であり、外生菌根菌ホンシメジにおいても遺伝子破壊試験にはKU80破壊株の利用が有効であることが明らかとなった。
今年度はさらに、菌根共生に関わる可能性が考えられるオートファジー関連遺伝子LsATG8およびNADPHオキシダーゼの制御因子であるLsNoxRについても、遺伝子破壊用プラスミドを構築し、アグロバクテリウムのコンピテントセルへと導入した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初、最大の目的としていたのは外生菌根菌ホンシメジにおいて標的遺伝子の破壊手法を構築することであった。これについては、KU80破壊株を親株とすることで約93%ときわめて破壊効率で実現することができた。実際に、４種の標的遺伝子（LsCHK1, LsMPK1, LsHOG1, LsPKA1）のうちすでに３種において２株以上の破壊株を作出できている。今後はこれらの破壊株を用いて宿主植物アカマツとの共生試験を行うことで菌根共生への役割の有無を調べていくことができる状況である。また、新たにLsATG8、LsNoxRの２種の遺伝子破壊用プラスミドをすでに構築しており、これまでのところ十分な成果を挙げることができているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、作出した３種のMAPキナーゼ遺伝子（LsCHK1、LsMPK1、LsHOG1）の各破壊株を用いて、菌根共生能力などの機能解析をすすめていく。具体的には、宿主植物アカマツとの共生試験により、マントル形成、ハルティヒネット形成などの有無を調べていく予定である。共生試験はすでにスタートしており、一部の破壊株については予備的なデータも得られている。また、共生能力以外にも、コロニー性状、菌糸形態、ストレス応答能力などを順次調査していく。また、新たに作出した２種の遺伝子破壊用プラスミド（LsATG8およびLsNoxR）についてもアグロバクテリウム法を用いて、KU80破壊株を親株に形質転換を行い、遺伝子破壊株を作出する。これらの株についても菌根共生試験を進めていく予定である。
また、各遺伝子破壊株の相補株を作出するために、薬剤耐性マーカーの種類が不足しているため、フルトラニル耐性遺伝子の利用を検討する。フルトラニル耐性遺伝子が利用可能になれば、各遺伝子破壊株の相補株を作出し、表現型解析を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
これまでの研究成果によりホンシメジの標的遺伝子の破壊手法が構築できた。このため、最終年度は当初の予定より多くの遺伝子破壊試験を試みる予定であり、多くの予算を必要とする。また、宿主との共生試験のためにも多くの予算が必要であるため、最終年度に予定よりも多い予算を設定した。
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