2018 Fiscal Year Research-status Report
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17K15296
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
津山 濯 宮崎大学, 農学部, 助教 (40786183)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | リグニン前駆物質 / トランスポーター / コニフェリン / p-グルコクマリルアルコール |
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| Outline of Annual Research Achievements |
木質バイオマスの有効活用を目指し、リグニンの生合成に関して多くの研究がなされてきたが、樹木分化中木部におけるリグニン前駆物質の細胞内から細胞外への輸送メカニズムについては、未だ概略すら明らかになっていない。これまでコニフェリルアルコールの配糖体であるコニフェリンのATP依存的輸送活性が広く木本植物に存在することを明らかにしてきたが、コニフェリンがどこにどのように輸送され、木化に用いられるかは明らかではない。そこで木本植物におけるリグニン生合成メカニズムの解明に寄与することを目的として、ポプラ分化中木部におけるコニフェリン輸送体の同定を目指した。
ポプラ分化中木部の組織を採取し、ミクロソーム膜画分を調製後、不連続ショ糖密度勾配法によりミクロソーム膜画分を分画した。各画分でのコニフェリン輸送活性を測定し、輸送活性の高い画分および低い画分を得た。輸送活性に差のある２つの画分を電気泳動に供さずそのままプロテオーム解析したところ、2000以上のタンパク質が同定された。高いコニフェリン輸送活性が見られる画分で発現量が大きかったタンパク質の中から、予想されるタンパク質の構造と機能から、34の候補タンパク質を絞り込むことに成功した。
また、ヒノキ分化中木部ミクロソームを用いてリグニン前駆物質の輸送活性を求めたところ、H核前駆物質であるp-グルコクマリルアルコールのATP依存的な輸送活性が存在することを新たに明らかにした。各種阻害剤を用いた実験より、この活性にはV-ATPaseが関与することが示唆される。
さらにモウソウチク当年稈からミクロソーム膜画分を調製しリグニン前駆物質の輸送活性を求めたところ、コニフェリンとp-グルコクマリルアルコールの輸送活性が見られた。このうちコニフェリンの輸送メカニズムは、ポプラおよびヒノキにおけるコニフェリン輸送メカニズムと同一であった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ポプラ分化中木部からミクロソーム膜画分を調製後、不連続ショ糖密度勾配法により分画し、コニフェリン輸送活性の非常に高い画分と、低い画分を得た。得られた膜画分を二次元電気泳動に供しPMF分析を行っていたが、膜貫通ドメインを持つタンパク質がほとんど同定されなかった。電気泳動時に膜タンパク質がうまく泳動されていないことが考えられたため、電気泳動に供さず膜画分を直接PMF分析に供した。その結果2000を超えるタンパク質が同定された。輸送活性が高い画分で発現が多く見られたタンパク質の中から、複数回膜貫通ドメインを持ちトランスポーターの機能が推定されるものを、合計34個絞り込むことに成功した。現在これらの候補遺伝子のクローニングを行っている。
今回、当初の計画に加え、ヒノキ分化中木部におけるp-グルコクマリルアルコールのATP依存的な輸送活性を明らかにした。各種阻害剤を用いた実験から、このp-グルコクマリルアルコールの輸送にはV-ATPaseが関与することが示唆された。このメカニズムはポプラにおけるp-グルコクマリルアルコール輸送のものと同一であり、またポプラおよびヒノキにおけるコニフェリン輸送のものと同一である。
ポプラ分化中木部におけるp-グルコクマリルアルコールの輸送はコニフェリンの存在により阻害を受け、その様式は混合阻害型であった。このことから、p-グルコクマリルアルコールの輸送はコニフェリン輸送体によってなされている可能性がある。
また、モウソウチク当年稈の木化組織におけるコニフェリンおよびp-グルコクマリルアルコールのATP依存的な輸送活性を明らかにした。コニフェリンの輸送活性にはV-ATPaseとH+勾配が関与することが示唆された。幅広い植物種に相同性の高いコニフェリントランスポーターが存在する可能性がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
ポプラ分化中木部におけるコニフェリン輸送体の同定に向けて、ポプラ分化中木部におけるコニフェリン輸送体候補遺伝子のクローニングを行い、BY-2培養細胞に発現させ候補タンパク質のコニフェリン輸送活性を明らかにする。
ポプラゲノムデータベースの情報を元にプライマーを設計し、絞り込んだ遺伝子の全長cDNAをRT-PCRにより単離する。得られたcDNAをベクターに組み込み大腸菌内で複製、プラスミドを抽出精製後、塩基配列の確認を行う。配列の確認ができた候補遺伝子のcDNAをバイナリーベクターに組み込み、アグロバクテリウムを組換える。組換えアグロバクテリウムをBY-2細胞に感染させ、BY-2培養細胞を組換える。組換えBY-2細胞を選択培地で選抜後、目的候補タンパク質を大量発現させる。目的タンパク質の発現および局在はSDS-PAGEおよび各種タグを用いて確認する。大量発現させたBY-2培養細胞からミクロソーム膜画分を調製し、コニフェリン輸送活性に差が無いか確かめる。さらに、これまでの生化学実験の結果からp-グルコクマリルアルコール輸送体も候補に含まれていることが考えられる。p-グルコクマリルアルコール輸送活性に差が無いかも同様に確かめる。
また、モウソウチク当年稈におけるコニフェリンおよびp-グルコクマリルアルコールの輸送活性について、詳細なメカニズムの解明に向けて解析する。さらに生化学的輸送実験により、樹木分化中木部あるいはタケ当年稈における新たなリグニン前駆物質の輸送活性が無いか調査する。これらにより得られるリグニン前駆物質の輸送に関する知見、リグニン前駆物質輸送体に関する知見は、随時、輸送体の同定に向けた実験に反映していく。
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