2018 Fiscal Year Research-status Report
新規ヒストンO-Glc NAc修飾による栄養状態依存的Nodal遺伝子制御機構
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17K15391
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Research Institution | Waseda University |
Principal Investigator |
新井 大祐 早稲田大学, 理工学術院, 講師(任期付) (20624951)
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Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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Keywords | エピジェネティクス |
Outline of Annual Research Achievements |
Nodal遺伝子はマウスES細胞においてエピジェネティック制御領域(ERE)により発現誘導されている。先行研究において、マウスES細胞ではEREがグルコース反応性のヒストン修飾であるH2AS40-Gcを受けており、培地中のグルコース濃度により修飾レベルが変化することを見出した。しかし前年度の研究より、培地中のグルコース濃度がマウスES細胞におけるNodal遺伝子の発現レベルに影響を与えないことがわかった。EREは細胞分化に伴いH3K27me3修飾を受けて機能が抑制される。そこで本年度はH2AS40-Gcの関わりを分子レベルで探っていくための準備として、EREの制御メカニズム、特にエピジェネティックな制御についての研究を進めた。前年度の研究でEREを様々な長さで欠失させたマウスES細胞を樹立している。これらの細胞の比較検討から、Oct4-Klf4モチーフを含む極めて短い領域の欠失がNodal遺伝子の発現を顕著に減少させるのに十分だとわかった。しかしながら、Oct4-Klf4モチーフ欠失細胞でもNodal遺伝子の発現は10%程度残存していたため、他の制御領域も発現誘導に参加していると考えられた。既知の関連シグナル阻害剤を用いた検討を進めているが、今のところマウスES細胞におけるNodal遺伝子発現を変動させるものは見つけられていない。CRISPR/dCas9法によりゲノム上の特定の領域にH3K27me3修飾を付加するためのベクター、同様にH3K27me3を脱修飾するためのベクターを構築し、機能評価を進めている。CRISPR/dCas9法による特異的効果と比較するため、EPZ6438処理により核全体にわたりH3K27me3を減少させたマウスES細胞について、RNA-seqによる網羅的遺伝子発現解析を実施した。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
グルコース濃度がNodal遺伝子の発現に影響を及ぼさないため、グルコース-H2AS40-Gc-遺伝子発現という単純なカスケードを描くことができず、明確な働きを示せていない。一方、EREを中心に詳細な解析を進めるための細胞やベクターの準備は十分に進んでいる。今後はEREを主軸に分子機構を調べていく。
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Strategy for Future Research Activity |
H3K27me3とH2AS40-Gcの相互関係を明らかにするため、CRISPR/dCas9によりH3K27me3レベルを増減させたEREのH2AS40-Gc状態をクロマチン免疫沈降法(ChIP)により解析する。また、H3K27me3によるEREの機能抑制がASEやPEEなど他の既知エンハンサーのH2AS40-Gcやクロマチン状態にどのような影響を与えるかをChIPやDNase感受性試験により確認する。Oct4-Klf4モチーフ欠失ES細胞をグルコース濃度の異なる培地で培養し、Nodal遺伝子発現やヒストン修飾、クロマチン状態への影響を調べることで、転写因子制御との関係を明らかにする。また、CRISPR/dCas9とO-GlcNAc修飾酵素・脱修飾酵素を組み合わせたゲノム標的特異的O-GlcNAc調節法を確立し、推測されたH2AS40-Gcの機能の証明に活用する。
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Causes of Carryover |
今年度は当初計画をやや変更し、研究ツールの準備や基礎的な検討を主に実施したため、残額が生じた。最終年度にChIPなど高額費用を要する解析を集中的に行うので、これに充てる。
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[Journal Article] Kakeromamide A, a new cyclic pentapeptide inducing astrocyte differentiation isolated from the marine cyanobacterium Moorea bouillonii.2018
Author(s)
Nakamura F, Maejima H, Kawamura M, Arai D, Okino T, Zhao M, Ye T, Lee J, Chang YT, Fusetani N, Nakao Y
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Journal Title
Bioorg. Med. Chem. Lett.
Volume: 28
Pages: 2206-2209
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research