2017 Fiscal Year Research-status Report
植物固有なスフィンゴ脂質糖鎖の形成機構と生物学的機能の解明
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17K15411
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| Research Institution | Saitama University |
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Principal Investigator |
石川 寿樹 埼玉大学, 理工学研究科, 助教 (20598247)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | スフィンゴ脂質 / スフィンゴリピドミクス / 糖鎖 / GIPC / 糖転移酵素 / シロイヌナズナ / イネ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
スフィンゴ脂質は生体膜上にマイクロドメインと呼ばれる特異分子集合を形成し、種々の生体膜機能に重要な役割を果たしている。植物は動物や酵母と異なる独自の糖鎖構造を有するGIPCと呼ばれるスフィンゴ脂質クラスをもつが、その形成機構および生物学的機能はよくわかっていない。本研究では植物GIPC糖鎖の可変構造基部を形成する糖転移酵素として、新たにN-アセチルグルコサミン特異的糖転移酵素であるGINT1を同定することに成功した。シロイヌナズナにおいてGINT1が種子特異的に発現し栄養組織と異なるスフィンゴ脂質組成を生じさせていることを見出し、さらに欠損変異体において種子サイズの肥大や発芽時のアブシシン酸感受性が低下することを発見した。また、種子特異的にGINT1が発現するシロイヌナズナと異なり、イネやタバコではすべての組織でGINT1が主要GIPC糖転移酵素として発現し機能していることを見出した。ゲノム編集によりGINT1を破壊したイネは植物体の正常な成長が進展せず枯死に至ったことから、植物種によってそれぞれ異なるGIPC糖鎖の生理機能が明らかとなった。以上の成果はPlant Physiol誌に投稿し受理された。さらに植物スフィンゴ脂質の迅速調製法とスケジュールMRM法を用いたLC-MS/MS分析の大規模化により、スフィンゴリピドミクスのハイスループット性を大幅に高めることに成功した。本手法を用い、多数の植物の地上部および種子におけるGIPC糖鎖構造の分布を網羅的にプロファイリングし、実用油糧作物を含む多くのアブラナ科植物において、シロイヌナズナと同様の種子特異的なGIPC組成を見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
先行研究におけるGIPC特異的マンノース転移酵素GMT1の同定に続き、その相同遺伝子の中からN-アセチルグルコサミン特異的糖転移酵素GINT1を同定することに成功した。レポーター遺伝子を用いた組織発現解析、スフィンゴリピドミクスと定量RT-PCRによる脂質組成と遺伝子発現の時空間的関連付けにより、GINT1がシロイヌナズナの種子特異的に機能していることを突き止めた。さらに遺伝子欠損変異体において、種子サイズが増大し貯蔵油脂およびタンパク質が増加していること、また種子発芽におけるアブシシン酸感受性が低下していることを明らかにした。さらにイネオルソログのゲノム編集による変異導入にも成功し、イネ植物体の生育に必須の遺伝子であることを明らかにした。シロイヌナズナを用いたスフィンゴ脂質糖鎖構造の人為的改変にも成功しており、異なる糖鎖構造がそれぞれ相補できない独自の生理機能を持つことを見出した。以上のように植物を用いた解析は計画を上回る進展を見せており、作出した遺伝改変植物系統を用いたさらなる機能解明が期待できる。一方、酵母発現系を用いた酵素活性試験系の構築を試みたが、こちらは有意な酵素活性の検出には至らなかった。酵母と植物では細胞内の糖ドナー代謝系および各種膜系への供給を担うトランスポーターに違いがあることが原因となり、複雑な植物型スフィンゴ脂質糖鎖の形成に関わる一連の代謝系を発現することが困難であると考えられた。最近新たに同定されたN-アセチルグルコサミン特異的トランスポーターを用いた新規酵母発現系を構築するとともに、無細胞翻訳系を用いたプロテオリポソームをベースとしたin vitro活性測定系の構築が必要であると考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
既報のGMT1および本研究で同定したGINT1について、それぞれの遺伝子破壊および異所的発現コンストラクトの導入を組み合わせることで、植物GIPCの糖鎖構造を人為的に改変した植物系統を作出した。今後はこれらを用い、糖鎖構造特異的な生理機能について、より詳細な解析を進める予定である。具体的には、これまでに明らかにしてきたGIPC機能として、細胞壁構造と病原応答に着目し、糖鎖構造の改変がこれらに及ぼす影響を解析する。またGIPCが集積する細胞膜マイクロドメインを生化学的に単離、その構成要素を解析することにより、GIPC糖鎖が生体膜機能に果たす役割を解明することを目指す。
また本研究で見出したシロイヌナズナgint1変異体における種子肥大および貯蔵油脂の増加に着目し、その実用化に向けた研究に着手する。GINT1が形成するN-アセチルグルコサミンを含むGIPC糖鎖はイネなど多くの植物で地上部の主要スフィンゴ脂質でありその欠損は致死性をもたらすが、シロイヌナズナではGMT1が形成するマンノース型GIPC糖鎖が主要であり、GINTの機能発現は種子に限定されている。これと同様の遺伝子発現およびGIPC分布パターンを持つ植物種においては、GINT1の機能破壊による種子生産量の増加が期待できる。シロイヌナズナと同じアブラナ科植物を中心に大規模なスフィンゴリピドミクス解析を行い、カメリナやセイヨウアブラナをはじめとする多くの実用油糧作物において、シロイヌナズナと同様の種子特異的なスフィンゴ脂質分布を明らかにした。これらの植物における糖転移酵素の発現とスフィンゴ脂質糖鎖の組織分布をさらに解析するとともに、内在性GINT1オルソログの機能抑制もしくは破壊系統の作出を進める。
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| Causes of Carryover |
予定していた多数の植物系統の育成については、先行研究からの引継ぎも含め効率良く段階的な作出を遂行することができたため、これにかかる人件費・謝礼を削減することができた。しかしながら結果として極めて多数の系統を保持することとなったため、その維持管理に今後人件費を投入する可能性がある。また学会等での発表および関連する研究内容の論文投稿については、国際共同研究かつ競合する他グループとの兼ね合いから、対外的な発表は最小限に抑えてきた。競合グループに先行する形で論文の受理に至ることができたので、今年度は積極的に学会発表および関連論文の投稿を推進することとし、これらに必要な助成金の使用を計画している。
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[Journal Article] GINT1 is a GIPC GlcNAc glycosyltransferase.2018
Author(s)
Ishikawa T*, Fang L*, Rennie EA, Sechet J, Yan J, Jing B, Moore W, Cahoon EB, Scheller HV, Kawai-Yamada M, Mortimer JC
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Journal Title
Plant Physiology
Volume: in press
Pages: -
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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