2017 Fiscal Year Research-status Report
細胞膜マイクロドメインが制御する植物免疫機構の解明
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17K15412
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| Research Institution | Saitama University |
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Principal Investigator |
長野 稔 埼玉大学, 理工学研究科, 助教 (80598251)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 植物 / 免疫 / 細胞膜 / マイクロドメイン / スフィンゴ脂質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、植物免疫における細胞膜マイクロドメインの役割を明らかにすることを目的としている。細胞膜上にはマイクロドメインと呼ばれる脂質・タンパク質集積ドメインが点在しているが、植物免疫との関わりは未解明な部分が多い。本研究では、マイクロドメイン主要構成脂質であるスフィンゴ脂質を改変することにより、マイクロドメイン減少シロイヌナズナを作出し、マイクロドメインと植物免疫の関係を解明しようと試みている。これまでにスフィンゴ脂質が有する2-ヒドロキシ脂肪酸がマイクロドメイン形成のキーとなることを明らかにしており、その合成酵素FAHに着目した研究を行っている。
2017年度はまずRNAi法を用いた2つのスフィンゴ脂質脂肪酸2-ヒドロキシラーゼ（FAH1, FAH2）のシロイヌナズナノックダウン系統（FAH1/2-KD）を整備し、スフィンゴ脂質分析を行った。その結果、2-ヒドロキシ脂肪酸を有するスフィンゴ脂質（2-ヒドロキシスフィンゴ脂質）が減少していることを明らかにした。次に、FAH1/2-KDに対してエフェクターAvrRPT2を有するシュードモナス菌の感染実験を行った結果、FAHがAvrRPT2が誘導する過敏感反応を正に制御することを明らかにした。一方、より2-ヒドロキシスフィンゴ脂質を減少させた系統を作出するために、ゲノム編集技術CRISPR/Cas9を用いてfah1変異体を作出した。既に存在していたfah2変異体と掛け合わせたfah1fah2二重変異体の2-ヒドロキシスフィンゴ脂質はFAH-KDよりも大幅に減少していた。fah1fah2に対してAvrRPT2を有したシュードモナス菌の感染実験を行ったところ、シュードモナス菌耐性がFAH-KDと同様にWTより減少しており、2-ヒドロキシスフィンゴ脂質が過敏感細胞死を制御することがより強固となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
シロイヌナズナのFAH1とFAH2のダブルノックダウン系統（FAH1/2-KD）と二重変異体（fah1fah2）を整備し、スフィンゴ脂質代謝への影響と、AvrRPT2が誘導する免疫機構をFAHが正に制御することを見出すことができた。特にCRISPR/Cas9を用いてfah1変異体を作出することにより、シロイヌナズナのFAHを完全にノックアウトしたfah1fah2二重変異体を作出できたことは、マイクロドメインと植物免疫の関係を明らかにするためのより良い材料を作製できたことになり、深い意味があると考えている。しかし、今年度はマイクロドメイン解析を行うまでに至らなかったため、「おおむね順調に進展している」とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
FAH1/2-KD及びfah1fah2においてマイクロドメインが減少しているか、脂質分析、及び顕微鏡を用いた解析を行う。また、AvrRPT2を有したシュードモナス菌以外の病原体に対する耐病性も明らかにする予定である。どのマイクロドメインタンパク質が免疫に関与するか明らかにするために、マイクロドメイン含有画分であるdetergent-resistant membrane（DRM）に存在するタンパク質のプロテオーム解析を野生型シロイヌナズナに加えてfah1fah2変異体を用いて行うことにより、網羅的にタンパク質を同定する。さらに、FAH過剰発現系統のスフィンゴ脂質分析や耐病性試験を行い、マイクロドメインの増加が耐病性に与える影響を調べる。
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| Causes of Carryover |
頭脳循環を加速する戦略的国際研究ネットワーク推進プログラムにより、2017年3月から2018年2月までの一年間フランスのボルドー大学に滞在していたため、未使用額が生じた。2018年度は、膜の流動性を可視化する試薬や細胞を培養するインキュベーター等、比較的高額な試薬や機器を購入し、さらに研究が進むよう役立てる予定である。
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