2018 Fiscal Year Research-status Report
Three dimensional dynamics of apical membrane ruffles on living cells by scanning ion conductance microscopy
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17K15541
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
水谷 祐輔 新潟大学, 医歯学系, 助教 (40646238)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | イオンコンダクタンス顕微鏡 / 細胞質突起 / アクチン線維 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡（SICM）を用いて、生きた細胞の頂上膜面の細胞質突起のダイナミクスを解析し、そのダイナミクスと細胞運動の関係性を解明することを目的としている。本年度については以下に示す課題に取り組んだ。
1. 改良型SICMを用いた薬剤付加時における細胞質突起の構造変化観察および検証： 昨年度、遺伝子導入により蛍光タンパク質と融合している細胞骨格関連タンパク質を発現する安定化細胞の作成に成功し、改良型SICMと蛍光顕微鏡による細胞質突起微細構造の変動とその直下の細胞骨格タンパク質を観察することが可能となった。その上でEGFなどの薬剤を付加し、細胞質突起の構造変化を経時的に観察した。現在、特徴的な変化を捉える測定条件の最適化をおこなっている。
2. 細胞周期の可視化が可能な安定化細胞の作出および改良型SICMによる観察： 細胞周期の各期および移行状態の細胞質突起のダイナミクスについて解析し検証を行うため、細胞周期の特定の時期にのみ存在するタンパク質に蛍光タンパク質を融合したプローブを細胞へ導入し、安定化細胞を作出した。これにより、細胞周期の進行の可視化に成功し、同細胞を用いて改良型SICMと蛍光顕微鏡による観察に成功した。また今年度は、長時間の経時的変化を観察することが可能になるように蛍光タンパク質が退色することを防ぐために顕微鏡光源の電動シャッターを顕微鏡システムに導入した。
3. 改良型SICMの分解能向上の検討： 装置自体の空間分解能を改善するために、探針であるガラスピペットの改良を進めている。既存のものはシングルバレル型であるのに対し、ダブルバレル型のピペットを用いることで探針の開口径を小さくした。このダブルバレル型のピペットを用いて固定した組織切片表面の観察、計測することにより検討をおこなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通り、改良型SICMを用いてCalpeptinやEGFなどの薬剤付加時における細胞質突起の構造変化を経時的に観察することを計画し、実行した。薬剤の適正な濃度などの実験条件の検討をおこない、現在、特徴的な変化を捉える測定条件の最適化をおこなっている。また、細胞質突起は細胞骨格関連タンパク質が芯となっているため、細胞質突起がよりドラスティックに変化するものと考えられる細胞骨格の重合誘導剤や脱重合剤などを付加した際の構造変化を観察することが重要であると考えられた。
一方で、細胞周期の可視化が可能な安定化細胞の作出において、当初の計画では3年目におこなう予定でいたが、昨年度に蛍光タンパクと融合している細胞骨格関連タンパク質を発現する安定化細胞の作出に成功したことから続けて実施した。その結果、計画よりも前倒しで細胞周期の可視化が可能な安定化細胞を作出することができ、改良型SICMと蛍光顕微鏡の同時観察による細胞質突起微細構造の変動を観察することができた。
また、前年度改善させた時間分解能だけではなく、空間分解能の改善も必要であると考え、ダブルバレル型のピペットを新たに導入し固定した組織切片表面の観察、計測することにより検討をおこなっている。これらを総合して、計画全体としてはおおむね順調に進捗している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度の検討結果により、当初予定していたCalpeptinやEGFなどの薬剤を付加し観察する検討方法から細胞質突起がよりドラスティックに変化するものと考えられる細胞骨格の重合誘導剤や脱重合剤などを付加した際の構造変化を経時的に観察する検討方法に切り替えることが必要であると考えている。これにより、細胞骨格の性状変化と細胞質突起の構造変化との関連を検討することで、細胞質突起微細構造の観察のみで細胞骨格の局在や状態を理解することが可能となる。
また、ダブルバレル型のピペットを用いた改良型SICMの分解能向上の検討を今年度も引き続き継続しておこなっていく。
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| Causes of Carryover |
当初の計画では、安定化細胞の作出が効率よく行かず、関連する試薬や物品が必要であると思われたが、予想以上に効率良く安定化細胞の作出をおこなえたことから、次年度使用額が生じた。現在、ダブルバレル型のピペットを用いた改良型SICMの分解能向上の検討をおこなっているが、それにともなうダブルバレル型のピペットに関する消耗品、さらに改良型SICMによる経時的観察にともなう画像データ解析に関する設備備品を新たに購入することを計画である。
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Research Products
(4 results)
