2019 Fiscal Year Research-status Report
Three dimensional dynamics of apical membrane ruffles on living cells by scanning ion conductance microscopy
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17K15541
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
水谷 祐輔 北海道大学, 総合IR室, 特任准教授 (40646238)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 走査型イオンコンダクタンス顕微鏡 / 細胞質突起 / アクチン線維 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は，走査型イオンコンダクタンス顕微鏡（SICM）を用いて，生きた細胞の頂上膜面の細胞質突起のダイナミクスを解析し，そのダイナミクスと細胞運動の関係性を解明することを目的としている。現在までに以下に示す課題に取り組んだ。
1. 改良型SICMを用いた薬剤付加時における細胞質突起の構造変化観察および検証： 昨年度，遺伝子導入により蛍光タンパク質と融合している細胞骨格関連タンパク質を発現する安定化細胞の作製に成功し，改良型SICMと蛍光顕微鏡による細胞質突起微細構造の変動と，その直下の細胞骨格タンパク質を観察することが可能となった。その上で細胞骨格に変化をもたらす薬剤を付加し，細胞質突起の構造変化の経時的観察をおこなった。
2. 改良型SICMの分解能向上の検討： 装置自体の空間分解能を改善するために，探針であるガラスピペットの改良を進め，通常約100 μmであった測定に使用するピペットの開口径を簡易的により小さくした。この改良されたピペットを用いて固定した組織切片表面の観察，計測することにより，検討をおこなった。
3. 細胞質突起の画像解析による抽出および計測の検討： 細胞質突起構造は細胞全体の全高に対し微小な突起構造であることから，画像解析による抽出をおこない，より詳細な計測の検討をおこなった。
4. 細胞周期の可視化が可能な安定化細胞の作製および改良型SICMによる観察： 細胞周期の各期および移行状態の細胞質突起のダイナミクスについて解析し検証を行うため，細胞周期の特定の時期にのみ存在するタンパク質に蛍光タンパク質を融合したプローブを細胞へ導入し，安定化細胞を作製した。これにより，細胞周期の進行の可視化に成功し，同細胞を用いて改良型SICMと蛍光顕微鏡による観察に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の計画通り，改良型SICMを用いて細胞骨格に変化をもたらす薬剤付加時における細胞質突起の構造変化を経時的に観察することを計画し，安定的に成功している。その上で薬剤の適正な濃度などの実験条件の検討をおこなった。細胞質突起は細胞骨格関連タンパク質が芯となっているため，細胞質突起がよりドラスティックに変化するものと考えられる細胞骨格の重合誘導剤や脱重合剤などを付加した際の構造変化を観察した結果，薬剤濃度について，非常に薄い濃度でも構造変化をしていることが示唆される結果を得られてきた。
また，本研究を通して改善させた時間分解能だけではなく，空間分解能の改善も必要であると考え，簡易的に開口径を小さくしたピペットを新たに導入し固定した組織切片表面の観察をおこなった。その結果，空間分解能の改善が認められ，組織切片表面から細胞内小器官であるミトコンドリアや小胞体，核などの液中観察に成功した。
一方で，細胞周期の可視化が可能な安定化細胞の作製において，作製後，改良型SICMと蛍光顕微鏡の同時観察による細胞質突起微細構造の変動を観察することができたが，細胞の状態が不安定であることが認められたため，改良をおこなう必要があり，対応中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究課題を通じた実験結果により，細胞質突起がよりドラスティックに変化するものと考えられる細胞骨格の重合誘導剤や脱重合剤などを付加した際の構造変化を経時的に観察する検討方法に切り替えたが，その結果，非常に薄い濃度でも構造変化をしていることが示唆される結果を得られ始めてきた。また，簡易的に開口径を小さくしたピペットを用いたことで空間分解能も向上したことから，画像解析による突起構造の抽出も合わせておこなうことで，より詳細な計測の検討をおこなった上で本研究課題をまとめる。
細胞周期の可視化が可能な安定化細胞の作製については，研究遂行上，最適な細胞が欠かせないことから，研究協力者に助言を頂きながら改良を続ける。
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| Causes of Carryover |
当初の計画通り，細胞周期の可視化が可能な安定化細胞の作製および改良型SICMによる観察をおこない成功には至ったが，研究途中で細胞の状態が不安定であることが分かった。研究遂行上，最適な細胞が欠かせないことから再度，安定化細胞の作製に取り組んだが，既存の物品で検討を繰り返したため，次年度使用額が生じた。
また一方で，本研究課題の結果の一部をまとめて論文投稿をおこなっているが，その結果，査読者からの追加実験を求められた。本研究目的をより精緻に達成するためには必要不可欠であったため，研究協力者とともにその内容にも取り組んでいたことから順調に消耗品購入が進まず，次年度使用額が生じた。
したがって，安定化細胞の作製に関する取組みに再度挑むため，遺伝子導入などにともなう新規の物品・消耗品の購入をおこなう。さらに改良型SICMによる経時的観察で得られた画像データのより詳細な解析をおこなうため，解析用PCなどを新たに購入することを計画している。
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