2018 Fiscal Year Research-status Report
3D-CLEM analysis of the membrane structure in autophagy
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17K15550
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
角田 宗一郎 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (80551209)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | オートファジー / 電子顕微鏡 / 三次元電子顕微鏡解析 / CLEM / 光-電子相関顕微鏡法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では３次元光ー電子相関顕微鏡法（3D-CLEM）の手法を確立すること、その応用としてオートファジーに関連する構造体の解析を行うことを目的としている。
３次元解析電子顕微鏡・集束イオンビーム走査電子顕微鏡（FIB/SEM）を用いた研究を進め、２本の論文として発表した（Ichimura K et al. Morphological processes of foot process effacement in puromycin aminonucleoside nephrosis revealed by FIB/SEM tomography; Kawasaki et al. Three-dimensional architecture of pericardial nephrocytes in Drosophila melanogaster revealed by FIB/SEM tomography.）。FIB/SEMと共焦点レーザー顕微鏡の観察部位を一致させる手法を改良し、単層培養細胞を蛍光顕微鏡で観察したのち、同じ方向から同じ場所をFIB/SEM観察することで、安定した相関顕微鏡解析（CLEM）を行うことが出来るようになった。これにより蛍光タンパク質を発現さえすれば、そのタンパク質が局在する微細構造を通常の電子顕微鏡レベルの解像度で解析することが可能になる。通常の免疫電子顕微鏡法よりも超微形態の保持性で優れており、一般的なCLEMよりも正確な構造の同定が可能である。またオートファジーに関連して共同研究を行い、二本の論文として発表した（Yamaguchi J et al. Atg9a deficiency causes axon-specific lesions including neuronal circuit dysgenesis, Furuya N et al. NDP52 interacts with mitochondrial RNA poly(A) polymerase to promote mitophagy）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
FIB/SEMの解析技術を習得し論文に繋げることが出来た。またオートファジーに関する共同研究にも進展があり成果を出すことが出来た。３次元光-電子相関顕微鏡法では、装置のトラブルや技術的な難点がありしばらく研究が滞ったものの最終的には解決し、当初の目的としていた手法を確立することが出来た。すでにいくつかのオートファジー関連構造をこの手法で観察することに成功している。
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| Strategy for Future Research Activity |
３次元光ー電子相関顕微鏡法の新法を確立することが出来たため、今後はこれを用いたオートファジーの解析を行う。すでに観察は行なっているが、異なる条件での解析、定量的な解析を行なっていく。課題としては撮影した電子顕微鏡写真の画像解析を現在は手作業で行っているが、膨大な時間がかかる。これを半自動化出来るようなプログラムやソフトウェアを利用できれば大幅に効率が改善するであろう。また本課題の最終年となるため成果をまとめて原著論文として発表していきたい。そのためには超微形態解析以外の手法も合わせて進めていく必要がある。
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| Causes of Carryover |
年度末に開催された学会参加費用として少し多めに確保していたため
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