2017 Fiscal Year Research-status Report
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17K15588
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
住谷 瑛理子 北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 助教 (50724754)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 骨髄腔 / 骨髄ストロマ細胞 / RANKL |
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| Outline of Annual Research Achievements |
哺乳類の造血の場である骨髄が正常に形成されることは、生体が免疫機能を発揮する上で重要である。本研究は骨の発生過程において骨原基に侵入する間葉系細胞集団を解析し、骨髄形成および免疫機能に重要な骨髄ストロマ細胞を同定することを目的とする。
骨髄ストロマ細胞を分類する上での分子マーカー候補としてRANKLに着目し、まずマウス胎仔骨原基におけるRANKL発現細胞の分布を調べた。RANKL発現履歴のある細胞がtdTomatoで標識されるRANKL-Cre; Rosa26-tdTomatoマウス胎仔の大腿骨を経時的に採取し、tdTomato陽性細胞の局在を調べた結果、tdTomato陽性細胞はE14.5頃に骨原基中央部の軟骨膜に出現し、E15.5には骨原基内への侵入が認められた。出生後のマウスでは骨芽細胞、骨細胞に加え、骨髄中に存在する突起構造を持った細胞がtdTomato陽性であった。この結果は胎仔RANKL発現細胞が、骨芽細胞系譜の細胞やストロマ細胞に分化する可能性を示唆する。そこで胎仔期のRANKL発現細胞の細胞運命を詳しく追跡するために、RANKL発現細胞を時期特異的に標識するRANKL-CreERT; Rosa26-tdTomatoを作成した。しかしながらこのマウスはタモキシフェン投与によるRANKL発現細胞でのtdTomatoの誘導が見られなかったため、以降の解析を中止した。一方で胎仔RANKL発現細胞を特異的に除去したPrx1-Cre; RANKL-iDTRマウスを作成し出生直後の大腿骨を解析したところ、骨髄中の血球減少がみられ、胎仔RANKL発現細胞が骨髄の形成に寄与することが示唆された。さらに、E15.5骨原基の細胞を単離して一細胞遺伝子発現解析を行った結果、胎仔RANKL発現細胞の分子マーカー探索に向けた候補遺伝子のリストが得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画していたマウス胎仔骨原基におけるRANKL発現細胞の分布を明らかにすることができた。RANKL発現細胞のフェイトマップ解析は理論通りにマウスの細胞を標識できなかったため戦略を変更して継続している。一方、当初の計画を前倒しして胎仔RANKL発現細胞を除去したマウスを作成し、胎仔RANKL発現細胞が骨髄形成に寄与することを示唆する結果が得られた。さらに、骨原基に存在する細胞の一細胞遺伝子発現解析を行うことで、次年度に向けて順調にデータを収集できたと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞標識がうまくいかなかったRANKL-Cre; Rosa26-tdTomatoマウスに代わり、胎仔RANKL発現細胞を時期特異的に標識する方法として、Tet-Offシステムを利用したRANKL-tTA; LC1; Rosa26-EYFPマウスを作成する。妊娠マウスのドキシサイクリンの投与を一過的に止めることで胎児期のRANKL発現細胞を時期特異的にEYFPで標識し、成体になるまで追跡することで胎仔RANKL発現細胞が大人の骨髄ストロマ細胞の起源であるかどうかを明らかにする。一方、一細胞遺伝子発現解析の結果から胎仔RANKL発現細胞に特徴的な遺伝子発現を明らかにし、この細胞を大人のRANKL発現細胞（骨芽細胞や骨細胞）と差別化するための分子マーカーXを同定する。さらに、X発現細胞を特異的に除去するマウス（RANKL-Cre; geneX-iDTRマウス）を作成し、骨髄の形成や出生後の免疫機能に対する影響の有無を検討する。
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