2018 Fiscal Year Research-status Report

ネクチン様分子による細胞膜受容体二量体化の阻害機構

Research Project

Project/Area Number	17K15597
Research Institution	Kobe University
Principal Investigator	慶田城迅神戸大学, 医学研究科, 特命助教 (00754558)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	Necl-4 / ErbB3
Outline of Annual Research Achievements	膜一回貫通型受容体であるErbB3は、ヘレグリンを受容するとファミリー分子であるErbB2とヘテロ二量体を形成し、細胞の生存や移動を制御している。研究代表者は、細胞間接着分子ネクチン様分子のNecl-4がErbB3と結合し、ヘレグリンによるErbB3 / ErbB2のヘテロ二量体化を阻害することを見出した。本研究では、Necl-4によるErbB3 / ErbB2のヘテロ二量体化阻害の詳細な機構の解明を目的として実験を行い、本年度は以下に示す結果が得られた。（１）Necl-4によるErbB3 / ErbB2ヘテロ二量体化の阻害機構を解明するためには、Necl-4とErbB3の複合体の結晶構造解析が有効であるため、組換えタンパク質を用い、東京大学の濡木理教授、石谷隆一郎准教授の協力のもとNecl-4 / ErbB3複合体の結晶化スクリーニングを実施した。その結果、Necl-4 / ErbB3複合体と考えられる結晶が得られ、その結晶をX線構造解析に供している。（２）Necl-4によるErbB3 / ErbB2ヘテロ二量体化の阻害に関与するNecl-4のアミノ酸配列を同定するため、結合部位を断片化して化学合成し、合成ペプチドの阻害効果を検討した結果、いずれの合成ペプチドでも阻害効果は得られなかった。Necl-4の結合部位はジスルフィド結合によりループを形成しているため、断片化によりループ構造が失われると、結合できなくなる可能性が考えられた。（３）Necl-4によるErbB3以外の膜一回貫通型受容体の制御機構を解析するため、結合タンパク質をスクリーニングするため実験系を樹立している。また、Necl-4の細胞外ドメイン内の二番目に位置するループ構造部分を組換えタンパク質として調整した際、多数のタンパク質が結合していることを発見した。質量分析を行った結果、肝細胞成長因子（HGF）受容体が同定された。現在、Necl-4がHGF受容体と結合し、機能制御をしているか検討を行うため、計画を立てている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初の予定どおり、Necl-4 / ErbB3複合体の結晶構造を解析するための準備が整い、結晶化スクリーニングを実施した。その結果、Necl-4 / ErbB3複合体と考えられる結晶が得られ、X線構造解析を行っている。またNecl-4の新規結合タンパク質も得られ、機能解析を含め、期間内に計画を遂行することができると判断している。
Strategy for Future Research Activity	これまでの計画に従い、Necl-4によるErbB3 / ErbB2のヘテロ二量体化阻害機構を分子生物学的・生化学的に解析していく。また、得られたNecl-4 / ErbB3複合体の結晶をX線構造解析により構造を同定し、Necl-4による阻害機構の分子基盤の解明を目指す。X線構造解析によりNecl-4 / ErbB3複合体の構造が同定できない場合は、クライオ電子顕微鏡などの方法も視野に入れ方針を検討する。さらにNecl-4と結合する細胞膜受容体である肝細胞成長因子（HGF）受容体が新規に同定されたため、Necl-4によるHGF受容体の機能制御の可能性について細胞生物学的に解析を進める。
Causes of Carryover	研究代表者は、東京大学理学部の濡木理教授、石谷隆一郎准教授の協力のもと、Necl-4 / ErbB3の結晶化スクリーニングを行った。タンパク質濃度や冷置時間など結晶化の条件を詳細に検討した結果、Necl-4 / ErbB3複合体と考えられる結晶が得られた。現在、X線構造解析により、Necl-4 / ErbB3複合体の構造解析を行っており、今年度中の結晶構造解析の実施を目指しつつ、前年度に引き続き、より精緻かつ発展的に研究を遂行するため、補助事業期間の延長と次年度使用するための助成金の申請を行った。Necl-4 / ErbB3複合体の構造が決定できた場合、両者の結合に重要なアミノ酸の同定を行い、それらの変異などにより結合の抑制や増強が制御できるか試みる。また、Necl-4の新規結合細胞膜受容体である肝細胞成長因子受容体に関しても、細胞生物学的な解析を進める予定である。